作者：南京鼓樓醫(yī)院    施曉雷  韓冰  丁義濤

    導讀：我國是乙肝大國，乙型肝炎病毒攜帶者約占世界總數(shù)的三分之一，其中相當一部分患者會逐步發(fā)展成急性或慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，最終發(fā)展為肝功能衰竭。然而，由于供體器官嚴重短缺等多種原因，目前僅少部分肝功能衰竭患者獲得肝移植機會。因此，能夠取代部分肝臟功能的人工肝支持系統(tǒng)得以迅速發(fā)展。

    人工肝支持系統(tǒng)包括非生物人工肝（ALS）和生物人工肝（BAL）。前者不含生物組分，主要利用濾過和吸附原理清除毒素，類似于血液透析治療。但ALS不能完全替代肝臟，這就促使肝病工作者致力于含有生物成分，能夠綜合發(fā)揮肝臟氧化脫毒、生物轉(zhuǎn)化、分泌與合成等功能的BAL研究。

    BAL核心元件一：生物反應器

    生物反應器是BAL核心組成部分，理想BAL反應器應能達到：①為肝細胞提供良好的長期生長代謝環(huán)境；②能發(fā)揮必需的肝臟功能；③體積小，死腔少。就結(jié)構(gòu)而言，目前生物反應器分以下4種。

    中空纖維管式  中空纖維管分為內(nèi)腔和外腔，一般將肝細胞黏附生長于外腔，內(nèi)腔有血漿通過，是目前應用最多的一類反應器。中空纖維管反應器最大優(yōu)點是較大的表面積/體積比，便于代謝物轉(zhuǎn)運，且保持最小死腔。但由于肝細胞在反應器中分布不均，易造成細胞活力下降。

    單層/多層平板式  該反應器是將肝細胞直接種植于平板上，優(yōu)點是細胞分布均勻，微環(huán)境一致，但表面積與體積之比下降。本中心在國內(nèi)第一個自主研發(fā)新型多層平板型生物反應器。反應器大致由三部分組成：多層平板、中空支架和外殼。本反應器特點為：①體積僅480ml,對人體血液動力學無影響；②能承載1010量級細胞，滿足臨床治療要求。此外，每層平板采用電紡方式引入殼聚糖納米纖維支架，促進肝細胞與材料間的黏附力，保證細胞數(shù)量及其功能維持。

    灌流床/支架式  該生物反應器提供固相載體使肝細胞黏附固定，肝細胞黏附并生長于孔隙中，大大降低因介質(zhì)流動而造成的剪切力損傷，細胞可維持較高功能活力，輻流式反應器即采用此種構(gòu)型，其缺點是灌注不均一，易堵塞。

    微囊懸液式  該生物反應器是將肝細胞用一種半透膜材料包裹，制成多孔微囊，然后進行灌注培養(yǎng)。其優(yōu)點是所有細胞具有相同微環(huán)境，有大量細胞培養(yǎng)空間，減少了免疫反應發(fā)生。缺點是細胞穩(wěn)定性差，物質(zhì)交換能力受限。

    BAL核心元件二：細胞材料

    細胞材料是BAL的核心部分，細胞在生物反應器內(nèi)的活性及自身功能在很大程度上決定了BAL的治療作用。

    人體肝細胞是上皮細胞源性，需要實質(zhì)細胞之間以及與非實質(zhì)細胞的接觸發(fā)揮作用，現(xiàn)有BAL裝置無法完全模擬肝細胞在體內(nèi)的微環(huán)境。在BAL使用時的肝細胞大多功能低下，關(guān)鍵酶活性喪失，嚴重影響B(tài)AL效能的發(fā)揮。

    理想的細胞來源應該是功能上接近在體肝細胞，來源廣泛且臨床應用時無免疫排斥反應及疾病傳播的可能。因此，尋找一種能在BAL中具有高活性、高穩(wěn)定性的細胞系，是目前亟待解決的問題。

    人類原代肝細胞  自體肝細胞理論上講不會發(fā)生免疫排斥反應，是理想的BAL細胞來源。但臨床上終末期肝病患者自身病態(tài)肝細胞數(shù)量和質(zhì)量均不能滿足BAL肝細胞的要求，不可能作為BAL的細胞來源。

    同種異體肝細胞是另一類較好的細胞來源，但因來源有限、同種異體存有免疫排斥及從人類組織中提取可能會傳播一些疾病，目前已基本被摒棄。

    永生化肝細胞  這類細胞采用成人肝細胞作為源細胞，免疫排斥反應小，但肝功能保留不全，還存在致癌及病毒感染風險。

    肝細胞株  在體外具有無限生長潛能的肝細胞株被證實是BAL一個有希望的細胞來源。這些細胞大多是從人類肝臟腫瘤細胞分化而來，而且在體外培養(yǎng)時顯示出了很好的耐受性。

    HepG2、C3A細胞株是腫瘤源性的肝細胞株，具有無限增殖能力，在體外培養(yǎng)顯示出良好的活性及穩(wěn)定性，且具有正常肝細胞的絕大多數(shù)功能，如白蛋白合成、P450活性及尿素代謝能力。但C3A細胞本身的代謝解毒能力較弱，且作為腫瘤源性細胞株，理論上仍存在腫瘤定植可能。

    異種肝細胞  異種肝細胞是指由各種動物肝臟分離而來的，其優(yōu)勢在于細胞來源穩(wěn)定、分離獲取方便且價格低廉。豬肝細胞是目前BAL基礎(chǔ)研究與臨床試驗中應用最為廣泛的一種動物源肝細胞。

    本中心從方便、實用、高效等原則出發(fā)，選擇異種豬細胞作為新型BAL支持系統(tǒng)的細胞來源。

    干細胞  干細胞是另一類很有希望的BAL細胞來源，在去分化狀態(tài)下無限增值，而且具有良好的分化能力，多種起源的干細胞在組織動員方面顯示有一定的前景，特別是在BAL.

    但是，目前應用于BAL的干細胞還處于未成熟階段。其存在問題是還沒有一種完全有效的純化和鑒別干細胞的方法，且目前尚無法使干細胞在體外擴增至1010數(shù)量級，這是其應用最大的“瓶頸”.

    BAL臨床應用前景和面臨難題

    BAL的臨床應用前景是令人鼓舞的，但其廣泛應用仍須努力攻克許多難題，如最佳細胞來源、體外細胞長期穩(wěn)定性和活性的提高、生物反應器重建肝臟三維結(jié)構(gòu)等。

    現(xiàn)有生物反應器設(shè)計只能體現(xiàn)肝細胞實質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用，而忽視了非實質(zhì)細胞的重要性。共培養(yǎng)策略可能是一個比較有前途的開拓領(lǐng)域，特別是肝細胞和非實質(zhì)細胞的共培養(yǎng)可以提高細胞與細胞之間的相互作用。

    肝臟中的肝細胞面臨著氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的濃度梯度，而這個梯度是隨著其與門靜脈距離改變而變化，正是由于存在這一梯度，肝細胞顯示了不同功能。為肝細胞可以繼續(xù)發(fā)揮在正常肝臟中的所有功能，未來的生物反應器可能需要重建這種微環(huán)境。

    隨著生物工程技術(shù)的不斷創(chuàng)新，未來的生物反應器應該最大化轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，這就需要發(fā)展一種稱為三維立體***，重建肝臟三維立體構(gòu)象，并能精確定位細胞位置。

    最終，理想的生物人工肝應該是由可完全吸收的生物人工肝置入性裝置來實現(xiàn)永久的肝臟替代作用。