一、簡介：

    SSR簡單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡稱SSR標(biāo)記），也叫微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個核苷酸（1-5個）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個核苷酸的重復(fù)序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位的次數(shù)的不同或重復(fù)程度的不完全相同，造成了SSR長度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標(biāo)記或SSLP標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計成對引物，通過PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點在不同個體間的多態(tài)性。

    優(yōu)點：
    （1）標(biāo)記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；
    （2）是共顯性標(biāo)記，呈孟德爾遺傳；
    （3）技術(shù)重復(fù)性好，易于操作，結(jié)果可靠。

    缺點：
    開發(fā)此類標(biāo)記需要預(yù)先得知標(biāo)記兩端的序列信息，而且引物合成費用較高。

    二、操作程序：

    取葉片→磨樣→提取DNA→PCR擴(kuò)增→電泳檢測→染色→讀帶標(biāo)記。

    1、DNA提取

    按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改進(jìn)的程序進(jìn)行，具體步驟如下：
    ① 成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，-20℃冰箱保存；
    ② 加入600μl 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30-60分鐘；
    ③ 取出，冷卻，上下?lián)u勻后，加入600微升24:1的氯仿異戊醇；
    ④ 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一個1.5ml的離心管中；
    ⑤ 加異丙醇，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液；
    ⑥ 干后用100%的灑精清洗，干后加適量TE。

    2、PCR擴(kuò)增

    模板DNA的濃度大約25ng/μl,擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl。具體如下：
    Sterile ddH2O        11μl
    PCR Buffer              3μl
    dNTP-mix                 0.5μl
    Primer1                     1μl
    Primer2                     1μl
    Taq polymerase      0.5ul（2U/μl）
    DNA                            3μl 
    PCR擴(kuò)增程序為：（2h30min）

    ① 預(yù)變性：94℃，5分鐘；
    ② 變  性：94℃，40秒；
    ③ 退  火：55℃  40秒；
    ④ 延  伸：72℃，1分鐘；
    ⑤ 循  環(huán)：從2到4共38個循環(huán)；
    ⑥ 72℃下最后延伸5分鐘；4℃ 5min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃的冰箱保存。

    3、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離

    制膠→灌膠→上樣→電泳。

    擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，步驟如下：
    ① 準(zhǔn)備電極液（1×TBE）；
    ② 將梳子撥出，并迅速用電極液沖洗膠面；
    ③ 不預(yù)電泳。
    ④ 點樣，電泳220V；
    ⑤ 拆板，并及時將內(nèi)板、邊條及梳子洗凈。

    4、凝膠染色

    ① 固定：10%醋酸，5分鐘；
    ② 染色：10分鐘；
    ③ 漂洗：dH2O，5-10秒；
    ④ 顯色：甲醛-NaOH，直到滿意為止；
    ⑤ 漂洗：dH2O，2分鐘。

    5、自封帶封膠，讀帶標(biāo)記，數(shù)碼照相攝像，室溫風(fēng)干。