目前，吉非替尼和厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已被證明是治療晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的有效靶向藥物，并只對表皮生長因子受體（EGFR）基因敏感突變類型的肺癌患者才顯示很好療效，肺癌患者在應(yīng)用EGFR-TKI靶向治療前進行EGFR基因突變檢測具有重要臨床意義，而檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性也將直接影響患者靶向治療選擇和療效。本文就肺癌EGFR基因突變的分子病理學(xué)檢測中主要的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證要點進行介紹。
 

    1、檢測實驗室及人員要求

    常規(guī)EGFR突變檢測方法基于基因擴增技術(shù)之上，其檢測應(yīng)嚴(yán)格在基因擴增實驗室進行，實驗室包括試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)等4個區(qū)。因肺癌EGFR檢測的標(biāo)本多為石蠟包埋的組織蠟塊，實驗室應(yīng)設(shè)置***的標(biāo)本制備預(yù)處理區(qū)（切片區(qū)），嚴(yán)防標(biāo)本在制片過程中被污染。各工作分區(qū)應(yīng)標(biāo)識清晰，儀器設(shè)備應(yīng)滿足檢測要求，各工作區(qū)專用的儀器設(shè)備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等不可混用。檢測過程中嚴(yán)格質(zhì)量控制，實驗完畢后做好清潔消毒工作。

    分子病理學(xué)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實驗室工作人員應(yīng)參加我國衛(wèi)生和計劃生育委員會指定的機構(gòu)舉辦的技術(shù)培訓(xùn)后取得合格證，并定期進行培訓(xùn)。

    2、EGFR突變檢測的標(biāo)本要求

    需要進行EGFR-TKI靶向治療的患者應(yīng)進行EGFR基因突變篩選；臨床標(biāo)準(zhǔn)（女性，無吸煙史等）不能決定是否進行檢測；有研究表明，免疫組織化學(xué)染色（IHC）檢出總EGFR蛋白表達(dá)也不推薦TKI治療篩選。

    EGFR突變檢測，對肺癌部分切除標(biāo)本建議用于腺癌和含腺癌成分的混合型肺癌，不考慮組織學(xué)分級；對肺癌全切標(biāo)本，不建議用于無任何腺癌成分的肺癌，例如純鱗癌、純小細(xì)胞癌或IHC未顯示腺癌分化的大細(xì)胞癌；對小標(biāo)本（活檢、細(xì)胞學(xué)標(biāo)本），如果不能完全除外腺癌，可檢測組織學(xué)表現(xiàn)為鱗癌或小細(xì)胞癌的標(biāo)本檢測，但應(yīng)結(jié)合臨床標(biāo)準(zhǔn)（年輕患者、無吸煙史）協(xié)助篩選；對初治患者，檢測原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶；對于多發(fā)性原發(fā)肺腺癌，可分別檢測，但不必對同一腫瘤多個區(qū)域檢測。

    在確定EGFR-TKI治療的進展期（Ⅳ期）肺癌患者，或低期別患者發(fā)生復(fù)發(fā)或進展（原先未進行檢測）時，應(yīng)行EGFR突變檢測。由于肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，對Ⅰ~Ⅲ期肺癌，在診斷時鼓勵患者進行檢測，以便出現(xiàn)復(fù)發(fā)時及時治療，但應(yīng)視具體情況決定。

    3、EGFR突變檢測流程

    標(biāo)本處理手術(shù)或活檢組織標(biāo)本應(yīng)在離體30分鐘內(nèi)用10%中性福爾馬林固定，避免用酸性、重金屬固定液或脫鈣液等處理；活檢小標(biāo)本固定6~24小時，手術(shù)切除大標(biāo)本固定8~48小時；細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可用于EGFR突變檢測，細(xì)胞石蠟包埋塊優(yōu)于細(xì)胞涂片。

    標(biāo)本評估及DNA提取對檢測標(biāo)本進行病理形態(tài)學(xué)評估是EGFR檢測最重要的質(zhì)量控制之一，病理醫(yī)生首先應(yīng)評估整個樣本中腫瘤細(xì)胞含量（腫瘤細(xì)胞百分比），確定標(biāo)本是否滿足檢測要求（所采用檢測方法的敏感性），必要時進行微切割富集腫瘤，EGFR突變檢測標(biāo)本使用的切片機刀架座須清潔并消毒，不同標(biāo)本切片時要更換刀片；制備3~10張厚8μm組織切片，對照HE染色結(jié)果刮取腫瘤細(xì)胞豐富區(qū)域，避開非腫瘤區(qū)和壞死區(qū)等；采用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提取基因組DNA，并測定DNA濃度。

    EGFR突變檢測EGFR突變檢測方法有很多種，應(yīng)結(jié)合檢測標(biāo)本特點來判斷是否進行檢測。最傳統(tǒng)的直接測序法（Sanger測序）可得到序列的直接信息，對未知突變的檢出具有優(yōu)勢，是直接有效地檢測基因突變狀態(tài)的方法，但敏感性較低，實驗操作時間長、步驟復(fù)雜、易污染。

    以實時定量PCR（RT-PCR）為平臺的突變檢測技術(shù)，均須根據(jù)已知的突變類型設(shè)計引物和探針，因此無法檢測出所有可能的突變，但敏感性較直接測序法高，操作簡單，不必對PCR產(chǎn)物進行操作，很大程度避免了擴增產(chǎn)物的污染。

    實驗室應(yīng)采用能在至少含50%腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本中檢測到突變的方法。推薦采用更敏感的方法，至少能在含10%腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本中檢測到突變，但不可一味追求高敏感性，而忽視對特異性和準(zhǔn)確性的考量。

    另外，不同實驗條件、不同樣本中檢測的最適方法也可能不同，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇適合的EGFR基因突變檢測方法，通過預(yù)實驗驗證所采用方法的準(zhǔn)確性和敏感性，無論采用何種檢測方法，臨床EGFR基因突變檢測應(yīng)能檢測所有突變頻率在1%以上的突變類型。

    EGFR突變檢測結(jié)果分析與報告EGFR突變檢測根據(jù)各自檢測方法的判讀標(biāo)準(zhǔn)分析檢測結(jié)果。測序法檢測EGFR基因突變，成功的峰形圖的峰形規(guī)則，如圖1，RT-PCR法檢測EGFR基因突變結(jié)果如圖2所示；如果檢測結(jié)果可疑（圖3，4），應(yīng)重復(fù)進行檢測或采用其他的檢測方法驗證。

    EGFR突變檢測報告須包括結(jié)果和說明，報告內(nèi)容應(yīng)讓腫瘤醫(yī)生和其他病理醫(yī)生易于理解，檢測實驗室收到標(biāo)本后2周（10個工作日）內(nèi)簽發(fā)報告，平均檢測周期＞2周的實驗室應(yīng)有措施（自身或第3方實驗室）來保證緊急病例能更快得到檢測結(jié)果。

    4、EGFR突變檢測的其他質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

    分子檢測實驗室人員應(yīng)嚴(yán)格按照已經(jīng)驗證的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進行EGFR檢測，EGFR突變檢測驗證應(yīng)與其他分子診斷相同，每次實驗設(shè)置陰性和陽性質(zhì)控，定期總結(jié)檢測結(jié)果，及時發(fā)現(xiàn)并解決問題。

    實驗室每月采用不同的檢測平臺驗證一定數(shù)量的EGFR基因突變檢測結(jié)果，每年應(yīng)至少參加兩次單項能力驗證（室間質(zhì)控）。

    驗證機構(gòu)有我國衛(wèi)生計生委病理質(zhì)控中心（PQCC），國際機構(gòu)如美國病理學(xué)家學(xué)會（CAP），歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟（EMQN）等。

    2013年肺癌相關(guān)研究：（按照時間順序）
    部分非小細(xì)胞肺癌無需行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)
    煙霧之殤 30年肺癌死亡率上升465%
    科學(xué)家發(fā)現(xiàn)肺癌生長的基因缺陷的圖譜
    NICE推薦肺癌表皮生長因子受體基因突變診斷試劑盒
    新研究證實琥珀酸脫氫酶5調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移
    研究發(fā)現(xiàn)與肺癌患者化療反應(yīng)相關(guān)基因突變
    肺癌抑制關(guān)鍵因子miRNA:miR-486
    新型血漿蛋白可更好檢出和排除肺癌
    WCLC:吳一龍教授對肺癌化療的5項疑問進行解析
    新型抑制劑有望克服ALK基因重排陽性晚期非小細(xì)胞肺癌
    非小細(xì)胞肺癌多學(xué)科綜合治療存在地區(qū)差異
    中國肺癌：近兩年肺癌診療的進展
    肺癌RAS基因突變后的用藥提議
    肺癌腦轉(zhuǎn)移或可通過生物標(biāo)記物精準(zhǔn)鑒別
    小細(xì)胞肺癌化療進展綜述
    肺癌免疫治療START研究結(jié)果公布
    肺癌與大腸癌共享致癌基因ALK和ROS1

    常見腫瘤基因檢測規(guī)范及進展相關(guān)文章：
    常見腫瘤基因檢測規(guī)范及進展：胃癌HER2
    常見腫瘤基因檢測規(guī)范及進展：肺癌EGFR
    常見腫瘤基因檢測規(guī)范及進展：乳腺癌HER2