幽門螺桿菌是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃腸道淋巴瘤的主要致病因素，并與胃癌發(fā)生密切相關(guān)，WHO將其列為第一級(jí)致癌物質(zhì)，流行病學(xué)調(diào)查表明，我國是胃癌癌的高發(fā)區(qū)及幽門螺桿菌高感染區(qū)，已對人民健康造成重大危害，盡管抗生素治療在幽門螺桿菌相關(guān)性治療方面取得了較大進(jìn)展。但其毒副作用明顯，療效不穩(wěn)定，無法解決其復(fù)發(fā)問題，人類與病原微生物的長期斗爭歷史表明，醫(yī)學(xué)教育——網(wǎng)搜集整理有效控制和徹底消滅某種傳染病的最佳途徑是疫苗接種，幽門螺桿菌疫苗接種將是預(yù)防幽門螺桿菌感染，降低幽門螺桿菌相關(guān)性疾病發(fā)病率的最佳選擇。

    1995年費(fèi)城會(huì)議上Rapuoli指出開發(fā)幽門螺桿菌疫苗需要至關(guān)重要的三種成分：①必須現(xiàn)能干擾粘附和毒性且存在于所有菌株的保護(hù)性抗原。如尿素酶、熱休克蛋白60、粘附素等；②臨床前試驗(yàn)需要能模擬感染和疾病的動(dòng)物模型，一種新的幽門螺桿菌感染小鼠需要新鮮的臨床分離株來感染小鼠，這一模型能重復(fù)人體疾病的諸多臨床表現(xiàn)，如上皮細(xì)胞損害和炎癥等；③需要有適用人體的粘膜佐劑，比較肯定的有霍亂毒素B亞單位、大腸桿菌熱敏毒素B亞單位等。

    1.抗原基因的選擇研究疫苗的首要任務(wù)

    便是尋找免疫原，Lazowskaetal在幽門螺桿菌蛋白免疫原的尋找方面作了較為出色的工作，最初應(yīng)用全菌抗原和膜佐劑口服免疫幽門螺桿菌感染的小鼠，成功誘導(dǎo)小鼠保護(hù)性免疫反應(yīng)，醫(yī)學(xué)教育——網(wǎng)搜集整理但全菌抗原成分復(fù)雜，副反應(yīng)多，研制幽門螺桿菌亞單位疫苗成為必然。幽門螺桿菌Ure基因組，由A,B,C,D四個(gè)亞基基因組成，基因結(jié)構(gòu)已清楚，其中A,C,D亞基免疫原性差，其免疫保護(hù)作用十分微弱，僅有UreB亞基能產(chǎn)生保護(hù)性免疫，是疫苗和診斷用抗原的主要候選基因之一；CagA基因較大，編碼分子量94KD的細(xì)胞毒性相關(guān)蛋白，是幽門螺桿菌的主要致病因子。因此研究UreB或CagA相關(guān)的疫苗將能有效預(yù)防致病幽門螺桿菌的感染和發(fā)病，Ure作為候選菌苗有許多優(yōu)點(diǎn)：

    在菌株中含量豐富，分布在細(xì)菌表面，廣泛表達(dá)和高度保守；其大分子量和顆粒狀結(jié)構(gòu)也更有利于粘膜免疫接種。Pappoetal用純化的HelicobacterfelisUreB亞單位和CT口服免疫小鼠后可抗Hf定植，而UreA亞單位則無保護(hù)作用，UreB亞互單位和LT口服免疫小鼠，同樣產(chǎn)生抗Hf感染保護(hù)力，重組的Ure和LT口服、鼻腔、直腸免疫同樣能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)力，Ure抗體被動(dòng)免疫小鼠后也能預(yù)防Hf感染的事實(shí)，間接說明Ure誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)力是體液免疫應(yīng)答介導(dǎo)的，螺桿菌屬的Ure同源性非常高，幽門螺桿菌UreB亞單位和佐劑CT口服免疫小鼠可抗Hf感染的事實(shí)，說明螺桿菌屬的Ure存在交叉性表位，免疫后可引起交叉性保護(hù)，目前在小鼠模型上已證實(shí)多種幽門螺桿菌抗原包括VacA,Ure,CagA,過氧化氫酶、幽門螺桿菌GroES類蛋白等。都可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)力。

    疫苗能否清除已有的感染？Doidge采用幽門螺桿菌超聲裂解物和重組UreB亞單位，結(jié)合CT口服免疫慢性幽門螺桿菌感染小鼠，結(jié)果證實(shí)口服免疫兼具預(yù)防和治療雙重作用，Doidge在Hm感染的雪貂中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。Ghiaraetal研究了幽門螺桿菌相關(guān)抗原作為疫苗治療慢性幽門螺桿菌感染效果，同時(shí)也試驗(yàn)大腸桿菌突變脫毒腸毒素作為粘膜佐劑的可能性，結(jié)果表明不管是幽門螺桿菌超聲裂解物或者重組蛋白VacA和CagA,與UTK63一起免疫，都成功地清除了小鼠體內(nèi)已有的幽門螺桿菌，并且免疫3mo后仍無感染，Marchettietal實(shí)驗(yàn)了LT,LTK63佐劑與全菌、內(nèi)源性VacA,Ure,CagA及重組VacA,CagA的免疫保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)都可激發(fā)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)。

    2.關(guān)于佐劑粘膜免疫

    需要強(qiáng)的佐劑以提高抗原的免疫原性，粘膜佐劑可**Th2型粘膜免疫反應(yīng)。未來的幽門螺桿菌疫苗必須輔以能有效誘導(dǎo)粘膜免疫的佐劑，活化Th2細(xì)胞免疫途徑，才能產(chǎn)生大量的slgA,才能克服幽門螺桿菌抗原性弱的問題。CT和LT是目前研究最為深入的粘膜免疫佐劑，它們都具有較強(qiáng)的粘膜免疫原性和粘膜佐劑效應(yīng)， 與不相關(guān)可溶性蛋白抗原同時(shí)口服免疫機(jī)體，能消除機(jī)體對這些免疫蛋白的耐受性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對CT及其免疫蛋白的長期免疫記憶。

    它們都能促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的抗原呈遞，選擇性誘導(dǎo)抗原特異性Th2細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的有絲分裂和B細(xì)胞種型分化，但由于CT口服時(shí)在某些品系小鼠誘生超敏反應(yīng)，而改用CT-B單位即可避免，故有人認(rèn)為CT-B是至今為止最為有效最為安全的粘膜免疫佐劑之一，目前人們更為青睞LT-B,因?yàn)長T-B較CT-B擁有更可靠的安全性和有效性，Michertietal在臨床實(shí)驗(yàn)了重組幽門螺桿菌Ure和LT口服免疫幽門螺桿菌染的志愿者的安全性和免疫原性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療患者僅出現(xiàn)腹瀉等，較少的副反應(yīng)；而使用脫毒LT可避免以上副反應(yīng)。LTK63與LT區(qū)別在于絲氨酸取代了第63位的賴氨酸，LTK63作為粘膜佐劑在動(dòng)物模型上已成功誘導(dǎo)抗原特異的體液免疫反應(yīng)和風(fēng)疹病毒特異的毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)，因此LTK63作為佐劑完全可能在未來臨床中用于幽門螺桿菌治療性免疫。最近Kinetal采用聚微囊包襄的全菌抗原口服免疫小鼠同樣可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的系統(tǒng)和粘膜免疫，免疫8wk后，胃腸液中抗幽門螺桿菌slgA和血清lgG仍維持較高平，幽門螺桿菌菌攻擊小鼠保護(hù)率高達(dá)95%,與CT,LT佐劑組對比無顯著差異，表明聚微襄顆?？梢哉T導(dǎo)針對幽門螺桿菌特異系統(tǒng)和粘膜免疫，并且可以作為未來幽門螺桿菌疫苗的佐劑。

    3.關(guān)于疫苗蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)及抗原表位預(yù)測

    抗體分子在抗原上的結(jié)合位點(diǎn)稱為抗原決定簇，又稱抗原表位。它是蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)，常出現(xiàn)在分子的高暴露區(qū)域，其性質(zhì)、數(shù)目及空間的構(gòu)型決定其抗原特性，為精確描述抗原決定簇，可用同源蛋白質(zhì)來評價(jià)特定氨基酸替換的影響以確定抗原表位的所在區(qū)，不過這里的表位是指“功能表位”,即一種蛋白質(zhì)能在免疫檢測中結(jié)合抗體的那一部分或片段、因此研究某種蛋白質(zhì)有意義的亞單位結(jié)構(gòu)和功能，它在實(shí)驗(yàn)使用上有實(shí)際意義。利用計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和抗原位點(diǎn)，這可作為抗原多肽合成試驗(yàn)的選段參考，適當(dāng)左右擴(kuò)展成10——20肽，也可用作抗原克隆表達(dá)實(shí)驗(yàn)前PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)模板范圍選擇的參考，使擴(kuò)增出的序列能夠覆蓋較多的預(yù)測點(diǎn)，這對我們研制幽門螺桿菌基因工程疫苗有重要指導(dǎo)意義。

    4.幽門螺桿菌疫菌的免疫保護(hù)機(jī)制

    免疫應(yīng)答類型的確定直接決定人類疫苗學(xué)研究發(fā)展，幽門螺桿菌感染的免疫應(yīng)答類型很難確定，這是因?yàn)樽匀桓腥居拈T螺桿菌后，引起的免疫反應(yīng)無保護(hù)性；而感染幽門螺桿菌的嚙齒類動(dòng)物，采用經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù)很難分析疫苗的治療性免疫應(yīng)答機(jī)制。最近有報(bào)道在幽門螺桿菌感染者胃粘膜中slgA水平明顯高于對照組，提示粘膜slgA在抗幽門螺桿菌感染中具有重要作用，Doigeetal用Hf超聲裂解物免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)抗螺桿菌slgA水平與保護(hù)作用密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞在幽門螺桿菌感染中的保護(hù)作用目前知之甚少。幽門螺桿菌感染患者外周血單核細(xì)胞的**和抑制作用已有報(bào)道，幽門螺桿菌感染的小鼠和人類，THI細(xì)胞被抑制，小鼠的保護(hù)性免疫與THI細(xì)胞抑制和TH2細(xì)胞活化密切相關(guān)。

    目前幽門螺桿菌疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫和治療作用的機(jī)制仍不清楚，Ghiaraetal認(rèn)為疫苗可能改變胃內(nèi)Thl型應(yīng)答反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)門HO或Th2型保護(hù)性反應(yīng)；并且在慢性幽門螺桿菌感染小鼠模型中出TH1細(xì)胞反應(yīng)口服幽門螺桿菌菌苗誘導(dǎo)THO或Th2細(xì)胞活化反應(yīng)，清除體內(nèi)感染的細(xì)菌，幽門螺桿菌感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)Th2反應(yīng)**程度與胃粘膜內(nèi)細(xì)菌減少和胃炎消退密切相關(guān)，幽門螺桿菌免疫小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IFN-γ下清Thl反應(yīng)，胃內(nèi)Th2細(xì)胞分泌IL-4水平增高；體外培養(yǎng)幽門螺桿菌免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)大量脾細(xì)胞中有幽門螺桿菌特異Th2細(xì)胞，脾細(xì)胞接種其他動(dòng)物發(fā)現(xiàn)明顯減少胃內(nèi)幽門螺桿菌感染量。Mohammadietal也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，并證明IL-4基因敲除小鼠體內(nèi)幽門螺桿菌感染數(shù)量明顯高于對照組，目前研究表明幽門螺桿菌慢性感染人群Thl細(xì)胞反應(yīng)占主要地位，人類胃粘膜反應(yīng)是否與小鼠相同？如果類似，采用無毒粘膜佐劑，治療性疫苗可能是清除幽門螺桿菌感染的新的方法。

    5.幽門螺桿菌感染的動(dòng)物模型

    研制幽門螺桿菌疫苗的先決條件是必須建立合適、穩(wěn)定的幽門螺桿菌慢性感染動(dòng)物模型，以分析免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)機(jī)制。在螺桿菌屬細(xì)菌中，Hf與幽門螺桿菌的生化特征和生物學(xué)行為最為接近，其16sDNA基因序列與幽門螺桿菌的同源性高達(dá)94.6%,Ure、過氧化物酶、過氧化氫酶均為陽性，生長條件相近，還具有相對較廣的宿主范圍，Hf在小鼠胃內(nèi)的定植無明顯部位特異性，與人幽門螺桿菌胃內(nèi)定植部位基本一致，并能引起與人類幽門螺桿菌相關(guān)胃炎相似的病理改變。王繼德博士etal研究證實(shí)無特殊病原菌級(jí)Balb/c小鼠對Hf易感，25只小鼠的感染成功率為100%,并能在胃內(nèi)長期存活達(dá)16wk以上，用ELISA法在感染16wk以后的小鼠血清、胃腸液中可檢出抗Hf-lgG抗體，并發(fā)現(xiàn)該抗體與幽門螺桿菌抗原有明顯的交叉反應(yīng)，這證明兩種細(xì)菌有許多共同免疫原，幽門螺桿菌定植成功的有悉生豬、狗和無胸腺小鼠。但這些動(dòng)物昂貴，需特殊飼養(yǎng)條件，且允許觀察時(shí)間不足1mo,國內(nèi)學(xué)者陳晶晶1990年最道了幽門螺桿菌的wistar大鼠模型的成功**，但不足之處在于幽門螺桿菌定植時(shí)間不超過1mo.有報(bào)道用靈長類動(dòng)物**幽門螺桿菌模型，由于靈長類動(dòng)物胃內(nèi)生理結(jié)構(gòu)與人類高度相似，可望獲得長期感染，但該純系動(dòng)物不易獲得，飼養(yǎng)困難，價(jià)格昂貴。另外由于幽門螺桿菌的動(dòng)物宿主譜較窄，其動(dòng)物感染模型尤其是常規(guī)小動(dòng)物長期感染模型的建立，向未兄有成功的報(bào)道。故人們在研究中廣泛應(yīng)幽門螺桿菌的近緣菌感染小動(dòng)物模型，Hf小鼠模型是最常用的一種。

    6.幽門螺桿菌減毒沙門疫苗

    沙門菌是寄生于人和動(dòng)物腸道的革蘭陰性菌，它可以作為其他病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體的蛋白、抗原或表位的表達(dá)載體，向機(jī)體輸送單價(jià)或多價(jià)抗原，誘發(fā)系統(tǒng)免疫和粘膜免疫，沙門菌通過其自然感染方式經(jīng)過粘膜侵入呼吸道、消化道、雌性生殖道等粘膜淋巴組織，M細(xì)胞取和運(yùn)輸抗原。觸發(fā)粘膜免疫反應(yīng)，**slgA特異的B細(xì)胞向其他粘膜組織遷移并分化成漿細(xì)胞，分泌slgA釋放到粘膜表面，防止病原體再度感染。此外沙門菌也可隨血流分布到機(jī)體的肝、脾和淋巴結(jié)等處，寄居在單核巨噬細(xì)胞中，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，減毒沙門活菌疫苗表達(dá)的外源蛋白，無論采用口服免疫、鼻腔免疫、直腸免疫或**免疫，都能誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生顯著而特異的免疫應(yīng)答，包括全身和粘膜的體液免疫應(yīng)答。目前沙門菌載體菌苗系統(tǒng)常見的突變株包括：Ty21a,aro,asd,cya,crp等突變株，其中aro基因突變株不僅高度減毒，而且具有良好的免疫原性，被廣泛用作表達(dá)多種異源抗原的載體，而cya,crp突變株不僅減毒具有免疫原性，而且是雙基因突變，回復(fù)突變的可能性極小，因此用該突變株作為載體菌苗很安全。目前減毒沙門菌疫苗研究多利用其天然宿主-小鼠來研究外源蛋白的免疫原性，人類應(yīng)用減毒沙門菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果，目前幽門螺桿菌減毒沙門菌苗載體多為沙門菌突變株，如aro、phoPc等。Gomez-Durateetal用表達(dá)幽門螺桿菌UreA,B亞單位的減毒沙門菌SL3261aro突變株，口服免疫Balb/c,C57/B6小鼠，然后用野生株攻擊，免疫組獲100%保護(hù)，對照組則無保護(hù)作用，血清、胃粘液中抗Ure抗體均升高，說明減毒沙門菌能表達(dá)強(qiáng)免疫原性UrE.Corthesyetal用表達(dá)Ure的phoPc突變株鼻腔免疫小鼠也獲得了滿意的保護(hù)率，能誘導(dǎo)體液吏疫和細(xì)胞免疫，并**T細(xì)胞增殖、分泌IFNγ，IL-2.IL-4,IL-5,IL-6等細(xì)胞因子，說明沙門菌表達(dá)的Ure特異誘導(dǎo)了Thl,Th2等淋巴細(xì)胞反應(yīng)。但是幽門螺桿菌減毒活疫苗的研究尚有許多困難待克服：①宿主對幽門螺桿菌減毒沙門菌苗的免疫應(yīng)答機(jī)制及幽門螺桿菌菌逃避甚至破壞機(jī)體的免疫應(yīng)答機(jī)制尚不清楚；②需進(jìn)一步提高減毒沙門活菌疫苗的安全性和免疫原性；③研制穩(wěn)定、高效表達(dá)幽門螺桿菌精制亞單位抗原的減毒沙門活菌疫苗。幽門螺桿菌感染與潰瘍和胃癌的相關(guān)性己廣為接受，耐藥苗株不斷增多以及發(fā)展中國家幽門螺桿菌感染率不斷增高的事實(shí)，使我們只有寄希望于疫苗來根治和預(yù)防幽門螺桿菌感染。國外幽門螺桿菌疫苗的研究已臨床前期試驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育——網(wǎng)搜集整理。

    因此我們研制價(jià)廉、高效，兼具預(yù)防和治療作用的疫苗已迫在眉睫。幽門螺桿菌菌體抗原成分復(fù)雜，含有多種外毒素致病因子，全菌粗制抗原易于引發(fā)不良反應(yīng)，幽門螺桿菌又難以大規(guī)模生產(chǎn)性培養(yǎng)；另外幽門螺桿菌減毒活疫苗的研究有許多問題待解決，目前正重點(diǎn)進(jìn)行組分疫苗及基因工程疫菌的研究，因此尋找和篩選的致病新基因是其疫苗研究工作的重點(diǎn)，由于任何一種幽門螺桿菌成分作抗原其免疫原性都較弱，因此聯(lián)合佐劑的亞單位疫苗能克服全菌疫苗的諸多不足；尤其是與佐劑一體化的亞單位基因工程疫苗的研究，是幽門螺桿菌疫苗研究的主攻方向之一。