五、CYP1B1基因與青光眼

    迄今為止人們通過典型家系的連鎖分析，共找到三個與原發(fā)性先天性青光眼相關(guān)的基因位點(diǎn)（GLC3A 、GLC3B、GLC3C），其中已經(jīng)確認(rèn)CYP1B1是位于GLC3A位點(diǎn)上的致病基因，而在其他兩個位點(diǎn)上仍未找到致病基因。最近，Ali等和Narooie-Nejad等報道LTBP2（Gene encoding latent transforming growth factor beta binding protein 2）的基因突變可導(dǎo)致原發(fā)性嬰幼兒型青光眼（PCG），該基因與GLC3C位點(diǎn)僅間隔1.3 Mb。

    （一）CYP1B1基因的發(fā)現(xiàn)和定位

    細(xì)胞色素P4501Bl（Cytochrome P4501B1，CYP1B1）是CYP超家族中家族1亞家族B的惟一多肽，是一種亞鐵血紅素一硫醇鹽單加氧酶，主要位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和外周膜結(jié)構(gòu)內(nèi)。

    1995年，Sarfarazi等用連鎖分析從17個土耳其家系中得到第一個先天性青光眼基因位點(diǎn)GLC3A，定位于2p21，D2S1788/D2S1325與D2S1356之間的染色體區(qū)域，其中11個家系符合該位點(diǎn)。隨后Plásilová等又在7個吉普賽人PCG家系中證實了該位點(diǎn)。1997年Stoilov等基于當(dāng)時的STSs和ESTs數(shù)據(jù)，聯(lián)合應(yīng)用STRs分子標(biāo)記、YAC克隆篩選及放射性雜交等技術(shù)，首先確定SPTBN1、hSOS1、PRKR、CYP1B1、SFRS7為GLC3A的候選基因，然后通過直接測序、尋找與表型共分離的突變位點(diǎn)，最終確定CYP1B1為PCG的致病基因。

    （二）CYP1B1基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)

    CYP1B1基因定位于2p21～22，全長8547 bp，由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成（OMIM 601771）。其轉(zhuǎn)錄子長度為5.1 kb，編碼區(qū)始于第二外顯子，編碼蛋白含543個氨基酸，是一種膜結(jié)合蛋白。CYPIB1蛋白C端半側(cè)具有細(xì)胞色素P450家族的保守核心結(jié)構(gòu)，包括四個螺旋束、螺旋J、K、兩個β折疊片層、血紅素結(jié)合域以及緊鄰血紅素結(jié)合域的曲折區(qū)域。這些保守結(jié)構(gòu)元件認(rèn)為是參與了和血紅素結(jié)合的重要功能。CYP1B1蛋白的N端為含有疏水氨基酸殘端的跨膜區(qū)域，緊鄰該區(qū)域的是富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)域（hinge region），該結(jié)構(gòu)域具有保持跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的曲折柔韌性的能力。

    CYP1B1可在全身多種組織中表達(dá)，如腎、心、脾、腦、肺、肝、骨骼肌、胸腺、腎上腺、睪丸、卵巢、子宮、乳腺、胎盤、小腸、大腸、淋巴結(jié)及外周血白細(xì)胞等，說明其在人類相關(guān)器官的分化、發(fā)育及功能行使中具有重要作用。

    人眼中CYP1B1 mRNA在虹膜和睫狀體中的水平相對高于角膜、視網(wǎng)膜色素上皮和視網(wǎng)膜。免疫組化分析提示CYP1B1蛋白表達(dá)在人胎兒和成人眼中小梁網(wǎng)是缺失的，但是在睫狀體非色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜中出現(xiàn)。不過也有證據(jù)表明，CYP1B1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在成年人的小梁網(wǎng)cDNA基因庫中能測到。在鼠和人眼中都有CYP1B1的保守表達(dá)，在眼各個組織中的表達(dá)不同，胎兒眼中表達(dá)高于成人，在眼的功能和發(fā)育過程中起作用。睫狀體上皮CYP1B1的改變會導(dǎo)致重要內(nèi)源性底物代謝的降低和缺失，從而引起發(fā)育缺陷。在青光眼患者中，睫狀體基因表達(dá)的突變可以直接導(dǎo)致眼內(nèi)壓的異常升高，或者中斷正常的小梁網(wǎng)發(fā)育過程從而間接地影響房水的流出。通過睫狀體衍生調(diào)節(jié)因子的代謝作用參與這些過程，從而影響IOP。CYP1B1可能是眼部發(fā)育相關(guān)的某種內(nèi)源性底物的重要代謝酶，如花生四烯酸類物質(zhì)經(jīng)CYP1B1催化后的代謝產(chǎn)物通過抑制眼前節(jié)上皮細(xì)胞Na＋-K＋-ATP酶的活性，從而調(diào)節(jié)角膜透明性和房水分泌。其組織特異性與眼前節(jié)的形態(tài)發(fā)育及功能形成密切相關(guān)，從而可能參與PCG的發(fā)生發(fā)展。

    （三）CYP1B1基因的突變研究

    CYP1B1 自發(fā)現(xiàn)之日起，在各人種人群先天性青光眼的篩查中不斷發(fā)現(xiàn)新的突變。與其他3個青光眼相關(guān)致病基因（MYOC、OPTN和WDR36）一樣，CYP1B1的突變率在具有家族史的患者中明顯高于散發(fā)病例。在家族性病例中，CYP1B1的突變率從100%（斯洛伐克吉普賽人）、92%（沙特**）到55.6%（巴西）。對于散發(fā)病例CYP1B1的突變率則從41.7%（巴西）、37.5%（印度）、34%（摩洛哥）、33.3%（印度尼西亞）、22.3%（歐洲）到20%（日本）。

    CYP1B1絕大多數(shù)的致病突變?yōu)榧兒贤蛔兓驈?fù)合雜合突變，偶爾也有報道單純雜合突變發(fā)病者。據(jù)統(tǒng)計CYP1B1的突變共有82個（表2）。

    表2列出了從PCG、PA、RA和POAG患者中發(fā)現(xiàn)的82個變異。包括46個錯義突變、10個無義突變、16個缺失、8個插入和（或）重復(fù)和2個同義突變。大約1/3的突變是基因插入或者缺失造成的，說明CYP1B1對于復(fù)合事件有較高的易感性。在POAG，PA和RA患者中CYP1B1突變比最初想象的具有更寬范圍的臨床表型。在PCG中，通過遺傳連鎖分析和突變掃描，CYP1B1最初被定位于GLC3A上。研究表示：CYP1B1是Peters′異常的一個致病因素，在這些患者中有4個位點(diǎn)的突變（Trp57stop、Met1Thr、Pro118Thr和Arg368His）和一個缺失（g.7889～7910缺失，R355～A358缺失）。另有證據(jù)表明，CYP1B1在病理生理學(xué)機(jī)制上和PCG以及其他的眼前節(jié)發(fā)育不良是相同的。

    研究發(fā)現(xiàn)，Rieger′s 異常中存在CYP1B1基因的突變（Trp57stop、g.4832～4834缺失、g.4838～4840缺失和g.8037～8046重復(fù)）。在PCG和POAG分離的特定家系中，這兩種形式的青光眼可能具有相同或重疊的CYP1B1介導(dǎo)的病理生理學(xué)機(jī)制。有研究揭示，在同一個家系中PCG和POAG的變異共存。此外，CYP1B1和MYOC變異的二基因遺傳導(dǎo)致的表型出現(xiàn)在更多報道中，提示CYP1B1可能是MYOC基因的修飾因子。但是，236個無關(guān)的法國高加索人POAG患者中的11個有CYP1B1的突變但MYOC基因沒有突變。這些個體為青年或者中年發(fā)病，發(fā)病時間顯著早于那些沒有攜帶CYP1B1突變基因的患者。除了一個無義突變，所有的這些突變都可以在PCG病例中檢測到。對印度人群的研究發(fā)現(xiàn)，200個POAG患者中的9個患者具有6個CYP1B1的突變。在這些突變中，其中1個是新發(fā)現(xiàn)的純合突變（Arg523Thr），3個是以前在PCG患者中報道過的（Trp57Cys、Glu229Lys和Arg368His），2個是新發(fā)現(xiàn)的雜合突變（Ser515Leu和Asp530Gly）。

    在一個青少年發(fā)病的POAG家系中（缺少M(fèi)YOC或OPTN突變）檢測到了Arg523Thr，這個位點(diǎn)與疾病共分離，是一種常染色體隱性遺傳方式。在這個研究中檢測到了在CYP1B1區(qū)域中所有新發(fā)現(xiàn)的突變（Arg523Thr、Ser515Leu和Asp530Gly），沒有包含PCG或其他眼前節(jié)發(fā)育不良中的錯義突變。Chen等在一個中國發(fā)育型青光眼家系中發(fā)現(xiàn)，兩個CYP1B1的SNPs （Arg48Gly和372-12 C>T）在所有的患者中都被檢測到，可能與MYOC基因的雜合突變Pro370Leu一起，對該家系的發(fā)育型青光眼共同作用。這些研究都提示CYP1B1在PCG和其他眼前節(jié)發(fā)育不良中起的致病作用比最初想象的更為重要，修飾POAG的病理發(fā)生過程，或者在一些條件下直接就是導(dǎo)致JOAG的主要原因。

    近兩年來，CYP1B1又有多個突變被發(fā)現(xiàn)與青光眼相關(guān)。Huang等在一例PCG患者上發(fā)現(xiàn)在CYP1B1基因的第二外顯子上有c.C319G、L107V兩個錯義突變，在其他的PCG患者上發(fā)現(xiàn)4個SNPs，分別為R48G、A119S、V432L和D449D 。

    Paolera等對30例巴西的PCG患者進(jìn)行CYP1B1的突變研究發(fā)現(xiàn)，其中9例（30%）有CYP1B1基因的突變，包括有已報道的突變Q19X、P437L、A443G、g.4340delG、 g.7901_79013delG- AGTGCAGGCAGA、g.8182delG、 g.8214_8215delG和三個新突變，分別是4635delT、4523delC和L378Q，以及3793T->C、R48G、A119S、L432V、D449D和N453S 多態(tài)性改變。

    Hilal等對90例摩洛哥的PCG患者以及100名正常對照組進(jìn)行了CYP1B1和MYOC突變分析的研究。在43例PCG患者中發(fā)現(xiàn)有12種CYP1B1的突變，其中有3個新突變，分別是 p.R163C、p.C470Y和g.4330-4331delTG，伴隨有中度或嚴(yán)重的表型。同時發(fā)現(xiàn)有2個新的基因內(nèi)多態(tài)性。g.4339delG 突變頻率最高，在31個家系中均有發(fā)現(xiàn)，其次是p.G61E。而其他突變，包括p.R163C、p.E173K、g.4330-4331delTG、p.E229K、p.R390S、p.R368H、p.R469W、p.C470Y和g.7901-7913del13bp則比較少。

    最初研究表明，CYP1B1基因的突變呈現(xiàn)完全外顯，但Bejjani等[65]在沙特的病例篩選中發(fā)現(xiàn)CYP1B1基因的外顯率大約僅為73%，因此推測可能另外存在非連鎖于GLC3A的抑制基因。此后突變體功能的研究證實，并非所有的突變均導(dǎo)致蛋白功能的完全喪失，有些突變?nèi)钥僧a(chǎn)生具有部分功能的蛋白。

    CYP1B1的突變大多位于富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和保守核心區(qū)，從而影響到分子的正確折疊、與血紅素結(jié)合的能力、形成復(fù)合物的穩(wěn)定性、對底物的作用等。Panicker等比較了45 位攜帶CYP1B1基因突變的先天性青光眼患者的基因型和表型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在所有的突變中移碼突變產(chǎn)生的表型最為嚴(yán)重，這可能是由于移碼造成CYP1B1 基因C端重要結(jié)構(gòu)域的全部丟失，產(chǎn)生無功能的蛋白所致。

    CYP1B1的晶體結(jié)構(gòu)還沒有被探明，但是可以根據(jù)許多P450的保守序列來推測。這些相似的模型提示CYP1B1錯義突變會影響到P450酶高度保守和重要的功能區(qū)域。例如：與Trp57Cys、Gly61Glu、Gly365Trp、Pro379Leu、Arg390His、Glu387Lys、Pro437Leu和Arg469Trp有關(guān)的突變在鉸鏈或保守編碼蛋白區(qū)域會破裂。另一個研究提示Asp192Val、Ala330Phe、Val364Met和Arg444Gln的突變會導(dǎo)致CYP1B1蛋白有意義的結(jié)構(gòu)改變。研究表明，野生型和突變型結(jié)構(gòu)對應(yīng)的8個PCG突變（Ala115Pro、Met132Arg、Gln144Pro、Pro193Leu、Glu229Lys、Ser239Arg、Arg368His和Gly466Asp）都可以發(fā)展為相應(yīng)模型來進(jìn)行研究。用這些模型來進(jìn)行分子動力學(xué)模擬實驗從而研究重要功能區(qū)的定時演變和結(jié)構(gòu)性的時間平均值。研究表明，對那些表現(xiàn)為腦回鈣化，牛眼，早發(fā)性青光眼的SWS患者需進(jìn)行CYP1B1的突變分析。因血管畸形引起的靜脈怒張以及增加的眼內(nèi)壓，均可能導(dǎo)致表型加重。這將有助于對病程的預(yù)后和治療，也可幫助對這些病例的廣泛咨詢[67]。

    六、結(jié)語與展望

    近年來，對POAG遺傳相關(guān)基因的研究很多，但仍存在很多問題：
    （1）目前只發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的3個基因，且這3個相關(guān)基因在此病產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚；
    （2）POAG遺傳基因存在地區(qū)差異性，研究所得基因缺乏全面性及針對性，不能代表普遍現(xiàn)象；
    （3）OPTN是不是POAG的第二個致病基因還存在爭議。MYOC和OPTN 基因之間可能產(chǎn)生相互作用，但具體原因也未明確；
    （4）基因打靶技術(shù)的應(yīng)用需要有具體的致病基因，但致使POAG產(chǎn)生的基因多樣且十分復(fù)雜，每個患者突變基因不同，因此很難應(yīng)用于臨床。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對青光眼相關(guān)致病基因研究將會更加深入和清晰。

    最近的結(jié)論已經(jīng)證實CYP1B1是PCG的致病基因，且作為POAG的修飾基因，但很少被認(rèn)為是POAG和其他一些眼前節(jié)發(fā)育不良的致病基因。CYP1B1缺陷鼠顯示了眼房水循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的異常，相似于人類PCG的患者。CYP1B1在青光眼中的作用到底是什么？目前的假說是CYP1B1代謝了內(nèi)源性的底物來產(chǎn)生發(fā)育中需要的代謝產(chǎn)物，或者清除發(fā)育中關(guān)鍵的底物。CYP1B1可能參與類固醇、花生四烯酸、維生素A以及N-乙酰-5-氧基色胺的代謝。所有這些代謝通路都可能產(chǎn)生信號分子來參與青光眼和其他眼前節(jié)發(fā)育不良的發(fā)展和病理生理過程。但是問題的關(guān)鍵是哪一個通路是致病性的及重要的，也不排除還有另外一個CYP1B1介導(dǎo)的通路參與青光眼的可能。在青光眼患者中觀察到的CYP1B1等位基因異質(zhì)性支持了這一假說，同時也說明很可能CYP1B1不同突變導(dǎo)致酶活性水平發(fā)生變化或者甚至改變了底物的特性。這可能影響了CYP1B1介導(dǎo)的代謝過程，在不同個體中CYP1B1代謝產(chǎn)物的濃度和產(chǎn)生不同的表型。

    目前關(guān)于PCG患者基因型（CYP1B1突變）-表型（房角發(fā)育不良的程度和疾病嚴(yán)重程度）的研究說明，特異性的CYP1B1的突變可能和房角異常嚴(yán)重程度有關(guān)，這些研究提供給青光眼專家分子學(xué)工具來診斷PCG。但是需要進(jìn)一步研究青光眼和其他眼前節(jié)發(fā)育不良疾病中CYP1B1的確切作用。CYP1B1缺陷鼠提供了很好的實驗?zāi)Ｐ?，可以研究野生型鼠和CYP1B1基因缺陷鼠的房水代謝過程來闡明CYP1B1代謝了內(nèi)源性的底物，從而在發(fā)育過程中產(chǎn)生或者消除對發(fā)育非常重要的底物。進(jìn)一步利用蛋白組學(xué)方法對這些鼠類在不同發(fā)育階段眼前節(jié)的基因表達(dá)，可以揭示CYP1B1在青光眼中起到的病理作用。（青光眼分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展 蔡素萍，陳曉明，閆乃紅，劉旭陽）