作者：程亮

    非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%,外科手術(shù)是最有效的治療方法，但僅適用于NSCLC中的一小部分無(wú)或局限性轉(zhuǎn)移的患者，并且很多患者手術(shù)治療后仍會(huì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。近年來(lái)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在肺癌致瘤中的作用以及針對(duì)EGFR的靶向治療備受關(guān)注，病理學(xué)家在如何篩選合理的EGFR靶向治療對(duì)象及判定檢測(cè)結(jié)果中起著關(guān)鍵的作用。本文總結(jié)了EGFR突變、基因拷貝數(shù)、EGFR過(guò)表達(dá)、磷酸化以及EGFR通路下游靶基因改變?cè)陬A(yù)測(cè)NSCLC患者EGFR靶向治療療效最新研究成果。同時(shí)闡述了KRAS和BRAF突變以及ALK基因重排在肺癌靶向治療中的作用。

    一、EGFR概述

    EGFR及其家族成員通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、凋亡、遷移及腫瘤血管生成發(fā)揮重要的致癌作用。EGFR信號(hào)分子改變涉及多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展。盡管EGFR突變通過(guò)何種信號(hào)途徑致癌的機(jī)制還不完全清楚，但明確的是EGFR突變能增強(qiáng)酪氨酸蛋白激酶活性。人類癌癥相關(guān)體細(xì)胞突變目錄 （COSMIC）中提供了有關(guān)NSCLC有意義的基因突變及靶向治療耐藥相關(guān)的突變基因信息（COSMIC, <http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/add_***/>）。EGFR基因位于7號(hào)染色體短臂7p12區(qū)，全長(zhǎng)200kb,包含28個(gè)外顯子，是編碼464個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。它的活化依靠與其配體結(jié)合。配體一旦與EGFR結(jié)合，受體形成同源或異源二聚體，活化自身酪氨酸蛋白激酶。配體結(jié)合引起的受體二聚化可導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，磷酸化是下游信號(hào)的關(guān)鍵分子事件。EGFR可以激活下游多種信號(hào)途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，遷移以及存活（圖 1）。EGFR在許多實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和存活中發(fā)揮著重要作用。EGFR 突變影響EGFR活化及過(guò)表達(dá)，而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 EGFR受體酪氨酸激酶可以通過(guò)兩個(gè)信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與存活：PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路以及 RAS/RAF/MEK/MAPK信號(hào)通路。這些下游信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、存活等重要生理過(guò)程，也參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成及腫瘤形成（圖1）。

    基于EGFR 基因激酶域基因突變理論研制的針對(duì)EGFR酪氨酸激酶的靶向藥物治療給NSCLC患者帶來(lái)了新的治療契機(jī)?？笶GFR的靶向治療主要有兩種方式：EGFR單克隆抗體（如Cetuximab、Panitumumab）以及小分子EGFR酪氨酸激酶拮抗劑（EGFR-TKI）。大規(guī)模III期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示臨床有效率15%到37.5%.臨床試驗(yàn)表明多種有EGFR突變的腫瘤對(duì)EGFR-TKI敏感，臨床有效率10%-30%.應(yīng)用最廣的EGFR-TKIs是吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）。這類藥物是可逆性抑制劑，它們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合在EGFR-TK上的活化位點(diǎn)發(fā)揮作用， 主要用于鉑類藥物化療失敗的病人 .已有222篇相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)EGFR 突變可預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者EGFR-TKI單藥療效。

    圖 1: EGFR 及其信號(hào)通路 EGFR單體胞外段有兩個(gè)配體結(jié)合域：一個(gè)是跨膜親脂結(jié)構(gòu)域和第18號(hào)到24號(hào)外顯子的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。配體與EGFR結(jié)合促進(jìn)胞內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，激活自身酪氨酸激酶而活化。EGFR活化驅(qū)動(dòng)了一系列信號(hào)途徑活化。主要有兩條通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活：PI3K/AKT/mTOR信號(hào)途徑和RAS/RAF/MEK/MAPK信號(hào)途徑。這兩個(gè)信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，引起細(xì)胞增殖，凋亡，遷移，存活以及血管生成等。

    二、 EGFR原癌基因突變、DNA拷貝數(shù)、蛋白表達(dá)以及EGFR下游信號(hào)分子的改變和NSCLC患者EGFR靶向治療的關(guān)系2.1 EGFR突變

    EGFR突變可使TK受體組成性活化，并與EGFR-TKIs敏感性相關(guān)。伴有這些突變的患者接受Erlotinib或Gefitinib治療后反應(yīng)率常大于70%.受體的不同突變位點(diǎn)具有不同的特點(diǎn)，而大多數(shù)突變會(huì)影響ATP結(jié)合位點(diǎn)，這也是TKI針對(duì)的靶點(diǎn) （圖2）。

    體外實(shí)驗(yàn)表明EGFR突變?cè)鰪?qiáng)TK活性，從而提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)TKI治療有效者常有EGFR基因第19號(hào)及21號(hào)外顯子突變，這些基因突變可用于篩選EGRF靶向治療對(duì)象。最常見(jiàn)的突變是第19 號(hào)外顯子上第745密碼子開(kāi)始缺失4個(gè)高度保守性氨基酸（LREA）。EGFR 突變者TKI治療有效率及無(wú)病生存期明顯好于無(wú)突變者。

    目前檢查突變最常用方法包括直接測(cè)序法及實(shí)時(shí)定量PCR,其它還有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（PCR-SSCP）分析和高分辨率熔解曲線分析（HRMA），蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)及多靶實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)腫瘤中常見(jiàn)的EGFR體細(xì)胞突變。這些敏感性和特異性高的試劑盒即使在混有野生型基因組DNA情況下，也能有效地檢測(cè)出EGFR突變。DxS Scorpions?技術(shù)可檢測(cè)第19號(hào)外顯子缺失突變（T790M, L858R, L861Q, G719Xs, S768I）以及外顯子中的3個(gè)插入突變 （2307_2308ins9, 2319_2320insCAC和2310_2311insGGT）。與直接測(cè)序相比，其它兩種方法在快速檢測(cè)EGFR突變上具有更高的特異性及敏感性。但臨床仍需應(yīng)用直接測(cè)序驗(yàn)證基因突變。目前國(guó)際上無(wú)EGFR基因突變檢測(cè)的指南，在檢測(cè)步驟中還需說(shuō)明EGFR突變位點(diǎn)的檢測(cè)數(shù)目。Jackman等發(fā)現(xiàn)223例未接受化療的晚期NSCLC患者中，EGFR 突變者TKI治療反應(yīng)率為67%,疾病惡化時(shí)間為11.8個(gè)月，總體生存時(shí)間為23.9個(gè)月。與第21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變相比，第19號(hào)外顯子缺失具有更長(zhǎng)的中位疾病惡化時(shí)間及總體生存時(shí)間。無(wú)論KRAS突變狀態(tài)，野生型EGFR突變預(yù)后常較差 （治療反應(yīng)率，3%;疾病惡化時(shí)間，3.2個(gè)月）。對(duì)于篩選EGFR-TKI一線治療對(duì)象的指標(biāo)而言，EGFR 基因型優(yōu)于臨床參數(shù)。

    圖2:EGFR活化突變以及EGFR靶向治療的機(jī)制  EGFR突變使EGFR酪氨酸激酶組成性活化?；罨腅GFR磷酸化激酶域的酪氨酸殘基，從而激活下游效應(yīng)子。EGFR靶向治療兩種方式：人源化的抗體（Y）以及酪氨酸激酶小分子抑制劑或TKIs （X）。抗體通過(guò)阻止配體與EGFR結(jié)合，抑制EGFR配體依賴的活化。TKIs通過(guò)阻止ATP與酪氨酸激酶胞內(nèi)端結(jié)合，抑制EGFR自身磷酸化。抑制酪氨酸激酶活性，干擾了下游信號(hào)途徑的活化。

    研究表明大于75%EGFR-TKI治療有效者具有EGFR突變活性。但是，一些伴有EGFR常見(jiàn)突變的二次突變常常對(duì)EGFR-TKI靶向治療有耐藥性。EGFR基因第20外顯子突變常對(duì)Gefitinib治療無(wú)反應(yīng)。而且，第20外顯子二次突變T790M占獲得性耐藥的50%.外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的耐藥性突變位點(diǎn)的檢測(cè)可早期確定是否具有獲得性耐藥。

    一些臨床前期試驗(yàn)表明EGFR-TKIs療效獲益不僅僅局限EGFR基因突變者?？赡芡蛔兓蛞酝獾姆肿訖C(jī)制也發(fā)揮著一定作用。EGFR基因擴(kuò)增以及受體/配體過(guò)表達(dá)等與EGFR抑制劑單藥敏感性相關(guān) .但I(xiàn)PASS臨床試驗(yàn)顯示EGFR基因拷貝數(shù)增加而無(wú)EGFR基因突變患者對(duì)EGFR-TKI治療不能獲益。

    2.2 EGFR 拷貝數(shù)的改變

    NSCLC中EGFR基因擴(kuò)增較常見(jiàn)，并常伴EGFR蛋白過(guò)表達(dá)?；驍U(kuò)增和7號(hào)染色體多倍體均可導(dǎo)致EGFR基因拷貝數(shù)增加。由于個(gè)體差異及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的差別，EGFR擴(kuò)增發(fā)生率12%-59%.部分研究表明EGFR基因的擴(kuò)增常與TKI治療后生存率高相關(guān)。EGFR 基因拷貝數(shù)增加常與TKI治療預(yù)后好相關(guān)。因此，基因拷貝數(shù)的增加可以作為預(yù)測(cè)TKI治療反應(yīng)性的一項(xiàng)指標(biāo)。

    EGFR體細(xì)胞突變與治療反應(yīng)率正相關(guān)具有肯定的結(jié)論。但EGFR基因拷貝數(shù)與EGFR-TKIs治療反應(yīng)性的關(guān)系尚未取得一致性的結(jié)果?？傊?，對(duì)于預(yù)測(cè)TKIs治療反應(yīng)性，EGFR 突變比EGFR基因獲得狀態(tài)更特異、更敏感[9].采用FISH檢測(cè)EGFR拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)30%的NSCLC有EGFR高拷貝數(shù)，雖然這些患者的EGFR突變狀態(tài)不清楚，但EGFR高拷貝數(shù)與TKI治療反應(yīng)性好相關(guān)。約70%EGFR高拷貝數(shù)患者同時(shí)伴有EGFR體細(xì)胞突變，這一點(diǎn)混淆了EGFR高拷貝數(shù)的真正意義。 IPASS臨床試驗(yàn)顯示EGFR突變是延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期最有效的預(yù)測(cè)因子。有些學(xué)者認(rèn)為EGFR基因拷貝數(shù)可用作預(yù)測(cè)NSCLC患者EGFR TKI療效反應(yīng)及生存獲益的指標(biāo)[16].但是IPASS臨床試驗(yàn)證實(shí)EGFR基因高拷貝數(shù)而無(wú)EGFR基因突變患者對(duì)EGFR-TKI治療不能獲益。Hirsch等認(rèn)為盡管EGFR突變及基因高拷貝數(shù)均能預(yù)測(cè)NSCLC患者Erlotinib療效，而EGFR拷貝數(shù)是預(yù)測(cè)不同患者Erlotinib治療生存獲益更有利的指標(biāo)。

    檢測(cè)EGFR基因拷貝數(shù)方法包括FISH,顯色原位雜交（CISH），實(shí)時(shí)定量PCR （qPCR）。采用PCR檢測(cè)EGFR 基因拷貝顯示EGFR拷貝數(shù)增加與生存期延長(zhǎng)顯著相關(guān)，提示其潛在的預(yù)后價(jià)值[9,21].EGFR 基因獲得可使疾病控制率從26%提高至67%,疾病進(jìn)展期從2.5個(gè)月延長(zhǎng)至9.0個(gè)月，生存時(shí)間從7個(gè)月延長(zhǎng)至18.7個(gè)月。值得注意的是EGFR基因拷貝數(shù)作為預(yù)測(cè)TKI療效的原因主要是其與EGFR突變相關(guān)。EGFR 突變是最好的療效預(yù)測(cè)因子。Hirsch等進(jìn)行的229例未經(jīng)化療的晚期NSCLC患者II期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果FISH以多于40%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)4個(gè)或更多拷貝數(shù)界定為拷貝數(shù)增加，76例患者中59.2%有EGFR基因拷貝數(shù)增加。EGFR有擴(kuò)增患者（45%）對(duì)治療的反應(yīng)好于無(wú)擴(kuò)增者（26%）。有EGFR 擴(kuò)增患者的中位無(wú)疾病進(jìn)展期為6個(gè)月，而無(wú)EGFR擴(kuò)增的為3個(gè)月。EGFR有擴(kuò)增組的中位整體生存時(shí)間為15個(gè)月，而無(wú)EGFR的擴(kuò)增組僅為7個(gè)月。

    盡管大部分研究顯示NSCLC患者EGFR基因高拷貝數(shù)與EGFR-TKIs治療反應(yīng)好及生存期長(zhǎng)相關(guān)，但對(duì)其是否具有預(yù)后價(jià)值仍存在爭(zhēng)論。有些研究認(rèn)為作為篩選靶向治療病人的預(yù)測(cè)指標(biāo)，EGFR基因拷貝數(shù)的敏感性和特異性均劣于EGFR突變。Douillard等也證實(shí)作為治療反應(yīng)性及無(wú)疾病進(jìn)展期的預(yù)測(cè)因子，EGFR突變優(yōu)于EGFR拷貝數(shù)。

    2.3 EGFR 蛋白過(guò)表達(dá)

    盡管EGFR過(guò)表達(dá)的研究非常多，但結(jié)果卻不盡如人意。40%-80%NSCLC患者有EGFR蛋白過(guò)表達(dá)，并且與預(yù)后差相關(guān)。最初設(shè)想EGFR抗體對(duì)治療EGFR過(guò)表達(dá)患者可能有效。但早期臨床試驗(yàn)提示EGFR過(guò)表達(dá)與抗EGFR抗體療效無(wú)明確相關(guān)性。此外，應(yīng)用免疫組織檢測(cè)EGFR表達(dá)不能作為預(yù)測(cè)Cetuximab靶向治療療效的可靠手段。

    部分研究顯示免疫組化檢測(cè)EGFR過(guò)表達(dá)與TKI治療反應(yīng)性好相關(guān)，但其它研究無(wú)類似結(jié)果。多因素分析顯示EGFR表達(dá)水平與NSCLC治療客觀反應(yīng)性及不良預(yù)后相關(guān)[18].幾項(xiàng)預(yù)后研究發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)與生存獲益不相關(guān)。因此，EGFR過(guò)表達(dá)不能作為NSCLC生存預(yù)測(cè)因子。不同研究結(jié)果之間的差異可能是由于免疫組化EGFR陽(yáng)性判定的臨界值及實(shí)驗(yàn)步驟無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化指南有關(guān)。

    2.4 EGFR磷酸化

    EGFR異?；罨谀[瘤發(fā)展及演進(jìn)中發(fā)揮著重要作用。此外，最新研究表明EGFR突變及EGFR磷酸化活化狀態(tài)可影響NSCLC患者臨床經(jīng)過(guò)。兩種主要EGFR信號(hào)途徑：（PI3K）/Akt/mTOR和Ras/Raf/MAPK均參與EGFR引起腫瘤細(xì)胞增殖與存活。這些信號(hào)途徑的活化依賴關(guān)鍵信號(hào)分子磷酸化的活化。NSCLC最主要的致瘤分子機(jī)制是活化性突變。調(diào)節(jié)EGFR表達(dá)的機(jī)制如表觀遺傳學(xué)及異常轉(zhuǎn)錄因子的研究尚未得出肯定結(jié)論。MicroRNA是EGFR調(diào)節(jié)因子。Weiss等檢測(cè)3株NSCLC細(xì)胞株及NSCLC患者發(fā)現(xiàn)2株細(xì)胞株及55%的NSCLC患者有microRNA-128b的缺失。并且他們認(rèn)為microRNA-128b可直接調(diào)節(jié)EGFR表達(dá)，microRNA-128b缺失與Gefitinib療效好及生存期長(zhǎng)相關(guān)。

    EGFR激酶域第845位酪氨酸磷酸化可以穩(wěn)定EGFR活化環(huán)，維持受體活化狀態(tài)，提供與底物蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。EGFR上另外兩個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)1068和1173可直接與GRB2直接結(jié)合，而且第1068位酪氨酸參與MAPK信號(hào)途徑的活化。

    EGFR活化可以通過(guò)抗EGFR磷酸化抗體檢測(cè)EGFR磷酸化狀態(tài)。EGFR基因C端磷酸化在募集信號(hào)分子及活化下游信號(hào)途徑中發(fā)揮著重要作用。Endoh等短時(shí)間隨訪97例 NSCLC患者發(fā)現(xiàn)，EGFR磷酸化抗體陽(yáng)性患者生存期更長(zhǎng)。Hijiya等應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)抗 992及1173酪氨酸磷酸化抗體在21例NSCLC腫瘤組織表達(dá)情況，他們發(fā)現(xiàn)第992位酪氨酸磷酸化與EGFR基因突變相關(guān)密切，提示EGFR磷酸化抗體可替代EGFR突變檢測(cè)，作為預(yù)測(cè)酪氨酸激酶抑制劑的療效的指標(biāo)。所以NSCLC患者應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)EGFR磷酸化狀態(tài)可潛在預(yù)測(cè)EGFR靶向藥物的療效，但仍需進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

    2.5 EGFRvIII

    EGFRvIII,一種最新發(fā)現(xiàn)的EGFR缺失突變體，是基因重排或mRNA剪切錯(cuò)誤所致的第2至第7外顯子編碼序列框內(nèi)缺失突變體。這種突變體比野生型EGFR少了267個(gè)氨基酸，在融合位點(diǎn)上形成了一個(gè)新的多肽。研究表明EGFRvIII突變體和野生型EGFR功能不同。盡管EGFRvIII不能與EGF等配體結(jié)合，但其自身酪氨酸激酶可組成性活化，受體自身磷酸化。 NSCLC常有EGFRvIII表達(dá)，且表現(xiàn)為活化的磷酸化狀態(tài)。因此，持續(xù)活化的EGFRvIII可能在肺癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也可作為抗肺癌藥物的潛在靶點(diǎn)。 針對(duì)EGFRvIII的特異性抗體也可用于肺癌的靶向治療。EGFRvIII特異性單克隆抗體可以抑制EGFRvIII高表達(dá)小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高小鼠生存時(shí)間。EGFRvIII特異性抗體只與EGFRvIII突變體結(jié)合，不能與野生型EGFR結(jié)合，因此應(yīng)用EGFRvIII抗體能更好的檢出EGFRvIII突變體。

    EGFRvIII突變體在NSCLC發(fā)病中的作用仍不太清楚。文獻(xiàn)中報(bào)道EGFRvIII突變體在NSCLC患者檢測(cè)率為0到42%.這些差異可能是由于檢測(cè)腫瘤的組織學(xué)類型不同或者技術(shù)誤差造成。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EGFRvIII突變體還存在于其它許多腫瘤。但是由于EGFR基因長(zhǎng)、基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜（含28個(gè)外顯子，全長(zhǎng) 約為190 kb）、第1內(nèi)顯子長(zhǎng)（123kb）并且常發(fā)生基因缺失，因此在基因水平檢測(cè)EGFRvIII突變非常困難。Okamoto等應(yīng)用免疫組化檢測(cè)EGFRvIII突變單克隆抗體在76例NSCLC的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)EGFRvIII在39% （30/76）的NSCLC中表達(dá)；而基因分析檢測(cè)EGFRvIII突變體僅為3%.他們還發(fā)現(xiàn)EGFRvIII也可以在正常肺組織中表達(dá)，因此對(duì)免疫組化檢測(cè) EGFRvIII突變產(chǎn)生了質(zhì)疑。

    研究證實(shí)了小分子TKIs對(duì)有EGFR激酶突變NSCLC患者的臨床靶向治療有療效。但是，這些小分子抑制劑是否能針對(duì)EGFRvIII突變尚不清楚。Ji 等[32] 報(bào)道EGFRvIII突變?cè)谌朔西[癌中的表達(dá)率為5% （3/56），但肺腺癌（0/123）中卻無(wú)EGFRvIII突變。他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)EGFRvIII突變的腫瘤對(duì)某些TKI有耐藥性，而對(duì)另一些TKI卻有反應(yīng)性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，加入不可逆的EGFR抑制劑HKI-272一周后能明顯縮小EGFRvIII致瘤小鼠的腫瘤體積。Erlotinib處理3只小鼠7天，腫瘤體積平均減少45%.而HKI-272處理后，腫瘤體積平均減少88%.轉(zhuǎn)染EGFRvIII 突變體的Ba/F3細(xì)胞對(duì)Gefitinib和Erlotinib耐藥，而對(duì)HKI-272較敏感。因此，應(yīng)用TKI對(duì)有EGFRvIII突變的肺癌患者具有潛在療效。

    三、EGFR 檢測(cè)和靶向治療

    由于EGFR 過(guò)表達(dá)作為預(yù)后因子的研究缺乏重復(fù)性，研究者致力于EGFR突變型特異性結(jié)合的抗體的研制。Cell Signaling公司（Danvers, MA）研制出兩種針對(duì)EGFR最常見(jiàn)突變位點(diǎn)的特異性抗體：第19號(hào)外顯子 15-bp/5-氨基酸缺失突變（E746-A750del）和第21號(hào)外顯子 L858R點(diǎn)突變。 Yu 等用這兩種抗體采用免疫組化的方法檢測(cè)40例NSCLC標(biāo)本中EGFR突變的基因型，并且每例均用DNA測(cè)序驗(yàn)證。這兩種抗體也可用于Western blotting、免疫熒光以及免疫組化染色。在340個(gè)石蠟包埋的NSCLC標(biāo)本中應(yīng)用這兩種抗體，與DNA直接測(cè)序及質(zhì)譜DNA測(cè)序相比，其敏感性和特異性分別為92%和99%.這表明應(yīng)用突變特異性抗體是篩選預(yù)測(cè)肺癌患者EGFR靶向治療療效的一個(gè)快速、敏感、特異及經(jīng)濟(jì)有效的方法。Brevet 等應(yīng)用這兩種EGFR突變特異性單克隆抗體在218例肺腺癌石蠟組織中進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)采用1+為陽(yáng)性臨界值，EGFR L858R點(diǎn)突變抗體的敏感性為95%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95%;若采用2+為陽(yáng)性臨界值，抗體的敏感性為76%,而陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%.因此，免疫組化檢測(cè)EGFR突變特異性抗體可以用于篩選EGFR靶向治療對(duì)象。

    筆者提出的非小細(xì)胞肺癌患者分子檢測(cè)流程（圖3）。 按肺癌突變的頻率逐步進(jìn)行分子檢測(cè)，并對(duì)肺癌患者進(jìn)行評(píng)估，從而給予相應(yīng)的靶向治療。
 

    圖3:小細(xì)胞肺癌分子檢測(cè)的流程  根據(jù)不同分子突變的頻率建議病人逐級(jí)檢測(cè)。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌85%,可檢測(cè)EGFR突變。EGFR突變陽(yáng)性，白種人占20%,東亞人占40%,EGFR TKI靶向治療有效率為80%. 無(wú)EGFR突變，白種人占 80%,東亞人占60%.這些病人進(jìn)一步檢測(cè)EML4-ALK突變，EML4-ALK 突變僅占NSCLC人群的3%,這類突變患者對(duì)靶向治療有效率為53%.無(wú)EML4-ALK突變還可進(jìn)行其他分子檢測(cè)3.2 EGFR 靶向治療

    兩種方法可以抑制EGFR信號(hào)途徑：一種是通過(guò)EGFR單克隆抗體阻止配體與胞外域結(jié)合，另一種是應(yīng)用小分子抑制胞內(nèi)酪氨酸激酶活性。后者首先應(yīng)用于臨床。EGFR-TKIs是通過(guò)可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP與EGFR-TK域的結(jié)合而發(fā)揮作用。體細(xì)胞EGFR活化突變，基因拷貝數(shù)增加，某些臨床病理特征等與NSCLC患者靶向治療療效好和預(yù)后佳密切相關(guān)。但這些患者的大部分都具有EGFR-TKIs 獲得性耐藥。EGFR基因二次突變位點(diǎn)T790M、表達(dá)HGF、PTEN和/或EGR-1以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）均與EGFR-TKI耐藥相關(guān)。Uramoto等發(fā)現(xiàn)8個(gè)T790M突變病例中6個(gè)高表達(dá)HGF,3個(gè)（38%）病例有PTEN缺失。7個(gè)病例中2個(gè)（29%） 有EGR-1缺失，其中一個(gè)有PTEN缺失。7個(gè)病例中4個(gè)（57%） 表達(dá)磷酸化Akt （p-Akt）。9個(gè)病例中4例（44%）在治療過(guò)程中出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。因此EGFR-TKIs 耐藥機(jī)制涉及基因、蛋白等多因素的改變。

    部分EGFR體細(xì)胞活化突變的NSCLC對(duì)酪氨酸激酶抑制劑具有反應(yīng)。如上所述，獲得性耐藥與EGFR二次突變位點(diǎn)T790M相關(guān)。Bell等[20]報(bào)道一個(gè)家族中多個(gè)NSCLC的發(fā)生均與EGFR T790M突變相關(guān)。EGFR信號(hào)通路的改變是家族性NSCLC遺傳易感的罪魁禍?zhǔn)?，使家族肺癌患者增加?br />
    3.2.1單克隆抗體

    Cetuximab和Panitumumab是人/鼠嵌合或完全人源性抗EGFR胞外域單克隆抗體，它們通過(guò)抑制活化的配體與EGFR的結(jié)合而發(fā)揮作用。這種靶向治療通過(guò)抑制配體依賴的EGFR的活化，從而抑制下游信號(hào)途徑活化，達(dá)到縮短細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及血管生成（圖2A）。此外，EGFR單克隆抗體還能促進(jìn)EGFR內(nèi)化、降解，終止EGFR信號(hào)途徑[26]. 完全人源性抗體Panitumumab與EGFR親和力高，其半衰期更長(zhǎng)。盡管NSCLC患者常表達(dá)EGFR,但抗EGFR抗體僅對(duì)部分患者有效。

    3.2.2 酪氨酸激酶抑制劑

    TKIs是人工合成的小分子，通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR TK域。Gefitinib和Erlotinib是針對(duì)EGFR特異的酪氨酸激酶抑制劑，但同時(shí)也可抑制其他受體，如HER2和VEGFR2.TKIs通過(guò)結(jié)合酪氨酸激酶，阻斷EGFR分子內(nèi)自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，阻止胞內(nèi)下游信號(hào)途徑的活化（圖 2B）。

    四、EGFR靶向治療耐藥性機(jī)制

    4.1 二次突變引起的獲得性耐藥

    盡管EGFR突變與Gefitinib和Erlotinib高敏感性相關(guān)，但仍有部分EGFR突變患者對(duì)EGFR-TKI治療并不敏感。EGFR-TKIs耐藥性可分為原發(fā)性耐藥和治療后引起繼發(fā)性耐藥。大部分病人對(duì) Gefitinib和Erlotinib初始治療敏感，但最終可發(fā)展為耐藥及疾病進(jìn)展。

    TKI藥物敏感性相關(guān)的突變主要有四種：第18外顯子點(diǎn)突變 （G719A/C）、第21外顯子點(diǎn)突變 （L858R和L861Q）以及第19 號(hào)外顯子從第745位賴氨酸殘基缺失4個(gè)高度保守性氨基酸（LREA）的框內(nèi)缺失突變。此外第20外顯子D770-N771插入突變也與EGFR-TKI耐藥性相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)第20外顯子插入突變對(duì)EGFR-TKIs反應(yīng)性比第19和第21外顯子點(diǎn)突變?nèi)酢?br />
    獲得性耐藥機(jī)制包括兩個(gè)方面：其一是在治療過(guò)程中EGFR基因出現(xiàn)了二次突變革變了EGFR蛋白質(zhì)編碼序列，其二是出現(xiàn)了其它原癌基因的擴(kuò)增。

    Kobayashi等報(bào)道一名接受Gefitinib治療達(dá)完全緩解，兩年后復(fù)發(fā)的NSCLC患者，其復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞除了有服藥前的EGFR突變位點(diǎn)外，第20外顯子上又出現(xiàn)了二次突變位點(diǎn)T790M.基因構(gòu)象及生物化學(xué)的分析表明二次突變可導(dǎo)致Gefitinib耐藥。Pao等幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)相同的突變位點(diǎn)T790M導(dǎo)致Gefitinib 或Erlotinib獲得性耐藥。Gefitinib耐藥病例EGFR激酶域均有T790M二次突變。第790位密碼子被稱為“管家密碼子”, 它決定了抑制劑與EGFR上ATP結(jié)合位點(diǎn)的特異性。EGFR第790位突變?yōu)榧琢虬彼?，使EGFR空間結(jié)構(gòu)改變，阻止與TKIs Gefitinib或Erlotinib的結(jié)合，產(chǎn)生耐藥。 這個(gè)突變位點(diǎn)有利于腫瘤細(xì)胞存活，也可作為篩選TKI靶向治療耐藥基因的指標(biāo)。這些耐藥基因的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了不可逆的EGFR-TKI靶向藥物的發(fā)展，尋找更好的針對(duì)耐藥的靶向藥物。

    EGFR下游癌基因KRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN的活化在治療反應(yīng)中作用也成為研究熱點(diǎn)。EGFR下游主要信號(hào)途徑RAS/MAPK和PI3K/AKT均參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及存活。EGFR下游信號(hào)途徑的突變也可導(dǎo)致EGFR-TKI耐藥。 研究發(fā)現(xiàn)MET激酶的擴(kuò)增以及EML4-ALK 融合基因的突變，可激活RAS/RAF/MEK通路，使EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥。

    4.2 KRAS 突變

    KRAS 在EGFR信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，原癌基因KRAS編碼的G蛋白是EGFR等生長(zhǎng)因子活化下游Ras/MAPK信號(hào)通路的重要蛋白。

    結(jié)直腸癌診治最重要的發(fā)現(xiàn)之一是KRAS的突變狀態(tài)與抗EGFR單克隆抗體（Panitumumab和Cetuximab）的靶向治療療效相關(guān)。部分腫瘤有KRAS基因第2號(hào)外顯子體細(xì)胞突變，RAS-GTP水解為GDP,激活RAS信號(hào)途徑。在KRAS突變的腫瘤中，KRAS蛋白持續(xù)活化，可以不依賴上游EGFR信號(hào)，從而對(duì)EGFR靶向藥物Cetuximab或Panitumumab不敏感。

    KRAS突變?cè)诜伟┗颊咧姓?5%-30%,在TKI治療無(wú)效者中約占35%-45%.大約30%的肺腺癌具有KRAS活化突變，與EGFR-TKI耐藥相關(guān)[40].值得一提的是，KRAS突變?cè)诜伟┲斜容^常見(jiàn)，但是KRAS和EGFR突變同時(shí)存在卻很少見(jiàn)。KRAS和EGFR突變很少同時(shí)出現(xiàn)在同一類型的腫瘤中，提示這些信號(hào)分子對(duì)NSCLC的發(fā)生和發(fā)展起著重疊作用。但是，越來(lái)越多證據(jù)顯示少數(shù)情況下EGFR和KRAS突變可以同時(shí)存在。 由于這種情況罕見(jiàn)，很難得出肯定結(jié)論，但是目前研究認(rèn)為EGFR/KRAS突變與EGFR-TKI療效負(fù)相關(guān)。

    關(guān)于KRAS突變是否可以用于評(píng)估EGFR靶向治療仍不清楚。盡管KRAS突變與EGFR-TKI治療無(wú)反應(yīng)相關(guān)，但與無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間以及總體生存時(shí)間關(guān)系尚不清楚。小樣本臨床試驗(yàn)證實(shí)KRAS突變是接受EGFR-TKIs治療的負(fù)相關(guān)預(yù)測(cè)因子，由于KRAS突變發(fā)生率低，目前缺乏大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。一些研究表明NSCLC中KRAS突變可作為抗EGFR單克隆抗體療效的負(fù)相關(guān)預(yù)測(cè)因子，也在TKI耐藥中發(fā)揮作用。與結(jié)直腸癌不同，在肺癌中KRAS突變不能作為篩選抗EGFR單克隆抗體治療不能獲益患者的指標(biāo)。

    KRAS突變出現(xiàn)在第2號(hào)外顯子第12和13密碼子，激活EGFR非依賴的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Eberhard等[45]應(yīng)用測(cè)序檢測(cè)274位腫瘤患者EGFR第18-21號(hào)外顯子和KRAS第2外顯子突變情況，發(fā)現(xiàn)KRAS突變占21%,與Erlotinib聯(lián)合化療治療后患者疾病進(jìn)展時(shí)間及生存時(shí)間縮短相關(guān)。但有些報(bào)道認(rèn)為KRAS突變不影響EGFR-TKI治療效果。一項(xiàng)關(guān)于Erlotinib或Gefitinib單藥治療223例未接受化療的進(jìn)展期肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變與67%治療反應(yīng)率相關(guān)。無(wú)論KRAS突變狀態(tài)如何，野生型EGFR患者均與不良預(yù)后相關(guān)。

    Wang等應(yīng)用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)273位NSCLC患者KRAS基因12,13密碼子突變[47],120位患者接受了EGFR-TKI靶向治療，KRAS突變患者中僅5.3% （1/19）對(duì)治療有反應(yīng)，而無(wú) KRAS突變患者治療反應(yīng)率為29.7%.KRAS突變患者中位無(wú)疾病進(jìn)展期為2.5個(gè)月，而野生型KRAS患者中位無(wú)疾病進(jìn)展期為8.8個(gè)月。

    Linardou等應(yīng)用Meta分析得出 KRAS體細(xì)胞突變是晚期肺癌患者接受EGFR-TKI單藥治療療效負(fù)相關(guān)預(yù)測(cè)因子。17篇文獻(xiàn)中1008例NSCLC患者中165例 （16%）有KRAS突變。KRAS突變與TKI治療缺乏反應(yīng)密切相關(guān)。

    EGFR抑制劑獲益的患者需具備完整的KRAS基因，但這一點(diǎn)并不足夠，其他因素也可能產(chǎn)生對(duì)EGFR抑制劑耐藥性。NSCLC患者KRAS突變占20%,其中少于3%患者同時(shí)具有EGFR突變，其余97% 為野生型EGFR.KRAS/EGFR同時(shí)突變和EGFR野生型與EGFR靶向治療無(wú)反應(yīng)性相關(guān)。

    4.3 BRAF突變

    KRAS和BRAF基因位于EGFR信號(hào)通路下游，是該信號(hào)通路的基本組成成分。BRAF蛋白是依賴KRAS-GTP活化的絲/蘇氨酸激酶。BRAF主要功能包括通過(guò)磷酸化活化MAPK、MEK1和MEK2信號(hào)途徑。突變的BRAF蛋白激酶活性增加，使NIH3T3細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。不論KRAS是否有突變，BRAF突變都可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

    BRAF與KRAS突變呈現(xiàn)相互排斥的現(xiàn)象。BRAF突變與腺癌的不同的組織學(xué)亞型具有相關(guān)性。Yousem 等分析了222例無(wú)KRAS和EGFR突變的肺腺癌患者。其中10例腺癌有BRAF-V600E突變。 BRAF突變常見(jiàn)于微**亞型。 De等檢測(cè)了15例原發(fā)微**型肺腺癌，發(fā)現(xiàn)3例（20%）有BRAF突變。BRAF-V600E突變?cè)谂苑伟┗颊呱远啵?:4）。老年人發(fā)生小葉內(nèi)衛(wèi)星結(jié)節(jié)及N2期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多[48].腺癌大部分是伴有**狀亞型（80%）和細(xì)支氣管肺泡亞型（50%）混合亞型腺癌。由于小樣本量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目前仍不能肯定BRAF突變是否為肺癌***的分子亞型。

    結(jié)直腸癌患者中BRAF突變能降低Panitumumab或Cetuximab療效。通過(guò)對(duì)132例患者的回顧性研究分析，治療有效者均無(wú)BRAF突變，而79例無(wú)效患者中11位（14.0%）有BRAF V600E等位基因突變。

    然而與KRAS相比，BRAF突變?cè)贜SCLC患者中檢出率較低。據(jù)報(bào)道8%的BRAF突變位于BRAF激酶域。Brose等在292例NSCLC肺癌患者中發(fā)現(xiàn)5例（1.7%）有BRAF突變。其中，3例突變位于第11號(hào)外顯子，2例突變位于第15號(hào)外顯子。BRAF是EGFR下游信號(hào)分子，其是否能作為EGFR抑制劑療效的預(yù)測(cè)分子仍需大量臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。 V600E錯(cuò)義突變是BRAF蛋白質(zhì)第600位密碼子的纈氨酸被谷氨酸取代，90%惡性腫瘤中可以檢測(cè)出這種突變。惡性腫瘤常出現(xiàn)絲氨酸-蘇氨酸激酶BRAF點(diǎn)突變，它給部分 NSCLC患者靶向治療帶來(lái)新的契機(jī)。

    4.4 ALK 基因重排

    間變淋巴瘤激酶（ALK）基因編碼受體酪氨酸激酶，ALK融合蛋白是由ALK胞內(nèi)激酶域和其它基因的氨基酸端組合而成。部分NSCLC患者基因組有EML4-ALK融合基因。目前肺癌**發(fā)現(xiàn)7個(gè)融合基因。所有融合基因的ALK胞內(nèi)端酪氨酸激酶域均起始于第20號(hào)外顯子編碼的基因序列。EML4-ALK由第2號(hào)染色體短臂插入（p21;p23）引起，編碼活化的蛋白酪氨酸激酶。 有研究發(fā)現(xiàn)EML4-ALK基因融合是由EML4不同的外顯子與ALK結(jié)合而成。 ALK也可與其它基因結(jié)合形成融合基因，如KIF5B和TFG.活化的ALK通過(guò)激活下游PI3K/Akt和MAPK信號(hào)途徑參與抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。NSCLC人群中EML4-ALK融合基因陽(yáng)性率很低，大約6%[50].EML4-ALK基因融合以及EML4-ALK融合蛋白可活化 RAS/RAF/MEK/MAPK信號(hào)途徑。此外，其它兩種少見(jiàn)的ALK融合基因也有報(bào)道。攜帶EML4-ALK 融合基因的NSCLC患者均為野生型EGFR和KRAS.他們多為年輕人，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期，無(wú)吸煙史，腫瘤常呈實(shí)體型，且常出現(xiàn)印戒細(xì)胞。

    一項(xiàng)關(guān)于攜帶EML4-ALK融合基因肺癌患者服用MET/ALK小分子抑制劑，PF-02341066的I/II期臨床試驗(yàn)。19例攜帶EML4-ALK融合基因非小細(xì)胞肺癌患者，其中10例（53%）對(duì)PF-02341066客觀療效。其中15例（79%）在接受治療8周后發(fā)現(xiàn)腫瘤受到抑制，部分患者維持到40周，僅有4例出現(xiàn)疾病進(jìn)展。Kwak等 發(fā)現(xiàn)1,500例晚期NSCLC患者中82例攜帶ALK融合基因。其中大部分 （96%）為腺癌。94%患者既往接受過(guò)至少一項(xiàng)治療。82位患者均接受口服crizotinib（ALK TKI小分子抑制劑）治療，疾病控制率為90%,其中治療反應(yīng)率為57%,其余33%病情穩(wěn)定。Rodig等探討了關(guān)于西方人肺腺癌中ALK重排發(fā)生率以及重排特點(diǎn)，旨在優(yōu)化臨床檢測(cè)ALK重排的模式。他們應(yīng)用FISH和免疫組化檢測(cè)358例肺腺癌標(biāo)本，再次證明ALK重排與年輕患者，無(wú)吸煙史，臨床呈進(jìn)展期，組織學(xué)呈伴有印戒細(xì)胞的實(shí)體型腺癌相關(guān)。ALK重排不會(huì)同時(shí)伴有EGFR突變。這項(xiàng)研究證明西方人ALK重排少見(jiàn)，但卻代表了一個(gè)***的臨床亞型，并且有可能對(duì)這類患者選擇不同治療方法。對(duì)于可疑病例，F(xiàn)ISH和免疫組化同時(shí)驗(yàn)證對(duì)診斷肺腺癌ALK重排更準(zhǔn)確[52].Zhang等通過(guò)對(duì)266例中國(guó)NSCLC患者的研究，得出相似的結(jié)論。

    Shaw等在141例NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)19例（13%）有EML4-ALK融合基因，31例 （22%）有EGFR突變，91例（65%）兩者均為野生型[42].其它研究也表明EML4-ALK 和EGFR存在具有排斥性[42].但是，Tiseo等報(bào)道一例48歲無(wú)吸煙史的白種人診斷為EGFR突變和ALK轉(zhuǎn)位同時(shí)存在的肺癌患者，并且對(duì)Erlotinib耐藥，這可能代表一小部分NSCLC患者。EML4-ALK重排人群中無(wú)EGFR突變，而EGFR突變?nèi)巳簾o(wú)ALK重排[42]. 轉(zhuǎn)移肺癌患者，EML4-ALK重排與EGFR-TKI耐藥相關(guān)。

    與EGFR突變?nèi)巳汉鸵吧虴GFR/ALK人群相比，EML4-ALK融合基因肺癌人群更年輕，男性居多[42].但是，也有研究顯示男女相當(dāng)。EML4-ALK融合基因肺癌人群更多是無(wú)或少吸煙史。19例EML4-ALK陽(yáng)性肺癌中18例為腺癌，大部分為印戒細(xì)胞亞型。EML4-ALK代表NSCLC一種特殊的分子亞型。特別指出的是EML4-ALK融合基因肺癌患者不能獲益于EGFR-TKI靶向治療，需應(yīng)用ALK靶向藥物。

    總之，以EGFR為靶點(diǎn)的治療能有效治療NSCLC患者。EGFR突變可作為篩選EGFR-TKI靶向治療對(duì)象的指標(biāo)，同時(shí)也可作為EGFR靶向療效的預(yù)測(cè)因子。但是，越來(lái)越多證據(jù)顯示NSCLC具有多種亞型，每種亞型都具有各自獨(dú)特的分子改變。確定分子亞型、篩選靶向治療人群的指標(biāo)都是NSCLC個(gè)體化治療的關(guān)鍵。EGFR及下游因子檢測(cè)有助于篩選合理的治療對(duì)象，KRAS/BRAF 突變與EGFR突變存在相互排斥，很少同時(shí)出現(xiàn)在NSCLC患者。這也可能在肺癌病因?qū)W及EGFR-TKI靶向治療耐藥中發(fā)揮重要作用?？傊珽GFR或其下游關(guān)鍵分子靶向治療將成為未來(lái)NSCLC治療的規(guī)范化治療手段。聯(lián)合預(yù)測(cè)模式不能應(yīng)用于所有腫瘤類型，仍需更好地篩選合理治療對(duì)象，EGFR分子指標(biāo)仍需進(jìn)一步研究并結(jié)合臨床參數(shù)，更好指導(dǎo)NSCLC患者的治療策略，實(shí)現(xiàn)真正的個(gè)體化診治。

    參考文獻(xiàn)

    1.Cheng L, Alexander RE, MacLennan GT, et al. Molecular pathology of lung cancer: Key to personalized medicine. Mod Pathol 25:347-369, 2012.

    2.Cheng L, Eble JN （ed） Molecular Surgical Pathology, 1st edition, Springer, New York, NY, 2013.

    3.Cheng L, Zhang DY, Eble JN （ed） Molecular Genetic Pathology, 2nd edition, Springer, New York, NY, 2013.

    作者簡(jiǎn)介：

    程亮，現(xiàn)任美國(guó)印第安那大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系及泌尿系終身教授，分子診斷實(shí)驗(yàn)室主任，泌尿病理主任。程亮畢業(yè)于北京醫(yī)科大學(xué)（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部），后在美國(guó)Case Western Reserve University和Mayo Clinic接受專業(yè)病理訓(xùn)練，持有美國(guó)外科病理、臨床病理和分子遺傳醫(yī)師***?，F(xiàn)任Molecular Cancer （Associate Editor）， Eur J Cancer, Future Oncology, Urol Oncol, Crit Rev Hematol Oncol, Am J Surg Patholy, Mod Pathol, Hum Pathol,J Pathol, Histopathology, J Clin Pathol等30多個(gè)雜志的編委，在影響因子較高的期刊，包括PNAS,JNCI,J Clin Oncol, Cell Metabolism, Nature Biotechnol, Cancer Res, Oncogene和Clin Cancer Res,發(fā)表學(xué)術(shù)論文700多篇， 被引用超過(guò)23000多次（h-index,80）。主編和撰寫著作有Molecular Genetic Pathology, Urologic Surgical Pathology,Essentials of Anatomic Pathology,Atlas of Genitourinary Pathology,Molecular Surgical Pathology, Rare Urologic Tumors,Atlas of Anatomic Pathology,及Bladder Pathology.