傳統(tǒng)觀念認(rèn)為膿毒癥（sepsis）是一種失控的、持久性全身炎癥反應(yīng)。目前，人們漸漸認(rèn)識到，在膿毒癥的發(fā)病過程中機(jī)體并非處于一成不變的免疫激活狀態(tài)，負(fù)向調(diào)控（negative regulation）機(jī)制在膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。機(jī)體在免疫應(yīng)答正常或沒有外界急性損害的情況下，正向與負(fù)向調(diào)控處于平衡狀態(tài)并維持各項(xiàng)生命活動的正常運(yùn)行。但嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克及膿毒癥時(shí)機(jī)體不僅出現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)，而且存在著嚴(yán)重細(xì)胞免疫功能低下，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞大量凋亡和免疫無反應(yīng)性，這與免疫負(fù)向調(diào)控效應(yīng)密切相關(guān)[1, 2]。機(jī)體免疫功能障礙的原因是多方面的，不論是抑制性免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子還是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化均系負(fù)向調(diào)控發(fā)揮作用的重要途徑，深入了解負(fù)向調(diào)控在膿毒癥中的作用及意義，在關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行精確干預(yù)將有助于恢復(fù)機(jī)體正常的免疫應(yīng)答狀態(tài)、防止嚴(yán)重感染并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。

    1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控外周免疫反應(yīng)的負(fù)向神經(jīng)信號途徑

    中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控外周免疫反應(yīng)的神經(jīng)信號通路主要包括下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)等。當(dāng)機(jī)體受到感染等外來打擊時(shí)，可迅速產(chǎn)生應(yīng)激，調(diào)動機(jī)體內(nèi)部各系統(tǒng)發(fā)生變化，以維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，確保生長、再生與修復(fù)等基本生理功能正常。其中下丘腦-垂體-腎上腺軸及交感神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)中重要的“指揮者”與“執(zhí)行者”；與此同時(shí)，副交感神經(jīng)系統(tǒng)的植物神經(jīng)功能受到抑制。我們初步的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌激素對創(chuàng)（燒）傷后免疫功能及感染的反應(yīng)性具有重要調(diào)節(jié)作用。嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷和感染病理過程中，自主神經(jīng)系統(tǒng)以及下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活使應(yīng)激激素濃度增加，造成免疫麻痹、高代謝和心血管功能異常等；如不及時(shí)糾正，會出現(xiàn)惡病質(zhì)和進(jìn)行性器官功能障礙，甚至死亡。由此可見，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)功能失調(diào)是膿毒癥常見的病理生理反應(yīng)，弄清其確切發(fā)病機(jī)制無疑具有重要臨床意義。新近的臨床觀察表明，針對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能失調(diào)致病環(huán)節(jié)進(jìn)行有效干預(yù)，可能是防止嚴(yán)重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）的根本途徑之一[3]。

    既往許多研究主要關(guān)注下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)對外周炎癥免疫的調(diào)控，但有資料提示β腎上腺素能阻斷劑并不能完全調(diào)節(jié)外周自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡，故對神經(jīng)系統(tǒng)負(fù)向調(diào)控的研究日益受到重視，尤其是副交感神經(jīng)通路（主要通過迷走神經(jīng)）。迷走神經(jīng)是自主神經(jīng)系統(tǒng)的周圍部分之一，其節(jié)前神經(jīng)元位于腦干及脊髓灰質(zhì)內(nèi)，節(jié)后神經(jīng)元分散在效應(yīng)器附近，節(jié)前后纖維均為膽堿能神經(jīng)纖維（包括傳入和傳出纖維），迷走神經(jīng)的主要遞質(zhì)是乙酰膽堿。據(jù)報(bào)道，神經(jīng)系統(tǒng)通過迷走神經(jīng)能夠顯著、快速地抑制巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF）-α和高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）的釋放，減輕全身性炎癥反應(yīng)。這一生理機(jī)制稱作“膽堿能抗炎通路”，通過抑制促炎細(xì)胞因子的合成反饋地監(jiān)控和調(diào)節(jié)炎癥過程，該效應(yīng)主要依賴于細(xì)胞上煙堿型乙酰膽堿受體α7亞單位（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7 nAChR） [4]。研究證實(shí)，α7 nAChR廣泛表達(dá)于炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）等；我們新近發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）表面也存在此受體，適當(dāng)濃度煙堿刺激Treg可上調(diào)其主要表面分子T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原（CTLA）-4和叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）表達(dá)，最終增強(qiáng)Treg介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞免疫抑制活性；而α7 nAChR特異性拮抗劑能逆轉(zhuǎn)煙堿的上述效應(yīng)，表明α7 nAChR是介導(dǎo)Treg抑制效應(yīng)的受體之一[5]。此外，膽堿能抗炎通路可通過阻止T淋巴細(xì)胞的分化和成熟、抑制中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的殺傷功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。與已經(jīng)確認(rèn)的體液調(diào)節(jié)途徑相比，膽堿能炎癥反射調(diào)節(jié)途徑具有快速、局部化和綜合性的特點(diǎn)。迷走神經(jīng)傳出信號為神經(jīng)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)提供了直接通路，同時(shí)展示了新的概念：神經(jīng)-免疫軸通過神經(jīng)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，進(jìn)而控制炎癥反應(yīng)，自主神經(jīng)系統(tǒng)在大腦與免疫系統(tǒng)之間的雙向通訊中發(fā)揮了中樞監(jiān)控免疫狀態(tài)、控制炎癥反應(yīng)的作用[6]。

    2 膿毒癥病理過程中外周細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控作用

    在機(jī)體的負(fù)向調(diào)控途徑中，不同免疫細(xì)胞亞群發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，其中Treg日益受到高度關(guān)注。Treg作為一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的成熟T細(xì)胞亞群，不僅在免疫自穩(wěn)、移植耐受、腫瘤免疫、過敏反應(yīng)等方面具有重要意義，而且在感染免疫方面也可通過對細(xì)胞免疫抑制發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用[7, 8]。Treg的種類較多，一般依據(jù)其發(fā)育、特異性及作用機(jī)制多分為天然Treg和獲得性Treg。天然Treg主要由胸腺發(fā)育成熟后進(jìn)入外周淋巴組織，目前了解較多的是CD4+CD25+ Treg；獲得性Treg是成熟T細(xì)胞（CD4+CD25- T細(xì)胞）在外周淋巴組織中接觸特異性抗原或在免疫抑制因子如白介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β的作用下活化而誘導(dǎo)產(chǎn)生。業(yè)已明確，Treg的免疫調(diào)節(jié)表現(xiàn)為免疫抑制性與免疫無能性，其對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制反應(yīng)主要通過細(xì)胞接觸機(jī)制和細(xì)胞因子分泌方式起作用。Treg抑制機(jī)制的發(fā)揮涉及多個(gè)膜表面分子、細(xì)胞因子和其他可溶性因子的作用，其中TGF-β與IL-10作為主要抑制性細(xì)胞因子可介導(dǎo)其抑制功能的發(fā)揮，F(xiàn)oxp3則特異地表達(dá)于CD4+CD25+ Treg，其基因改變所致轉(zhuǎn)錄因子的功能異常直接影響Treg表型及活性的發(fā)揮。此外，IL-35是一種最近新發(fā)現(xiàn)的抑制性細(xì)胞因子，它可由CD4+CD25+ Treg特異性產(chǎn)生，是Treg發(fā)揮抑制作用所必須的細(xì)胞因子[9]。

    我們的資料證實(shí)，嚴(yán)重燙傷可使大鼠脾臟CD4+CD25+ Treg表面分子CTLA-4和Foxp3表達(dá)明顯增強(qiáng)，并促進(jìn)其免疫抑制功能成熟。與此同時(shí)，燙傷后脾組織CD4+CD25+ Treg分泌IL-10水平與假燙傷組比較也顯著升高[10]。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，燒傷后并發(fā)膿毒癥患者Treg表面CTLA-4及Foxp3表達(dá)顯著高于無膿毒癥患者，膿毒癥死亡組其表達(dá)亦顯著高于存活組。由此可見，嚴(yán)重?zé)齻纱龠M(jìn)外周血CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟，并刺激其分泌大量抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下甚至免疫紊亂的發(fā)生[10, 11]。那么是什么因素促進(jìn)了嚴(yán)重?fù)p傷后CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟呢？我們初步實(shí)驗(yàn)提示，HMGB1可作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，在外周參與調(diào)控Treg和T淋巴細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：燙傷后HMGB1的持續(xù)升高可刺激Treg向成熟發(fā)展，從而介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)低下，并向輔助性T細(xì)胞（Th） 2漂移，免疫功能受抑；HMGB1介導(dǎo)的Treg功能成熟還可通過下調(diào)T淋巴細(xì)胞核因子（NF）-κB活性而減少IL-2基因表達(dá)和蛋白合成，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)活性[10]。在此基礎(chǔ)上，我們觀察了HMGB1攻擊后不同基因型小鼠CD4+CD25+ Treg免疫功能的改變及其受體作用機(jī)制。給C3H/HeN和C3H/HeJ [分別為Toll樣受體4野生型（TLR4+/+）和天然突變型（TLR4-/-）] 小鼠腹腔注射不同劑量HMGB1，發(fā)現(xiàn)C3H/HeN小鼠CD4+CD25+ Treg表達(dá)CTLA-4水平顯著下降，同時(shí)生成IL-10量也明顯降低；但不同劑量HMGB1攻擊可引起C3H/HeJ小鼠CD4+CD25+ Treg表達(dá)CTLA-4明顯上調(diào)和生成IL-10量增加。提示TLR4在HMGB1誘導(dǎo)CD4+CD25+ Treg免疫活性過程中發(fā)揮了重要負(fù)向調(diào)控作用[12]。

    3 膿毒癥時(shí)參與免疫負(fù)向調(diào)節(jié)的新蛋白分子

    在急性損傷或膿毒癥過程中，一些免疫負(fù)調(diào)控分子發(fā)揮著重要作用。TNF-α誘導(dǎo)蛋白-8樣分子2 （tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2, TIPE2） 是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白分子，主要選擇性表達(dá)于淋巴源性和髓源性細(xì)胞。TIPE2是維持宿主免疫穩(wěn)態(tài)所必需的，主要通過對T細(xì)胞受體和Toll樣受體（TLRs）信號途徑實(shí)行負(fù)向調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體天然/獲得性免疫應(yīng)答過程[13, 14]。有資料證實(shí)，小鼠TIPE2基因主要表達(dá)于胸腺、脾臟、淋巴結(jié)以及小腸粘膜等免疫器官或組織中，而在肝臟、心臟、肌肉、睪丸以及正常鼠的神經(jīng)系統(tǒng)均無表達(dá)，但在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎動物模型呈高表達(dá)。而TIPE2基因敲除小鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)嚴(yán)重受損，TIPE2基因缺失的T細(xì)胞培養(yǎng)上清Th1型細(xì)胞因子干擾素（IFN）-γ、Th2型細(xì)胞因子IL-4均呈不同程度的增加。進(jìn)一步觀察證實(shí)，TIPE2與前凋亡caspase-8存在聯(lián)系，可能通過前凋亡酶調(diào)節(jié)NF-κB通路。TIPE2能下調(diào)激活蛋白-1和 NF-κB的活化，TIPE2基因缺陷細(xì)胞呈現(xiàn)對TLR和T細(xì)胞受體信號活化的高反應(yīng)性。此外，與正常野生型相比，TIPE2基因敲除動物出現(xiàn)明顯膿毒性休克反應(yīng)，TIPE2基因表達(dá)下調(diào)引起持續(xù)性淋巴細(xì)胞活化，可導(dǎo)致Fas表達(dá)增強(qiáng)并促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡[13]。

    我們采用共聚焦熒光法對CD4+CD25+ Treg細(xì)胞內(nèi)TIPE2的分布進(jìn)行初步定位，并從基因和蛋白水平檢測到Treg 細(xì)胞內(nèi)TIPE2表達(dá)。結(jié)果顯示，CD4+CD25+ Treg細(xì)胞胞漿中高表達(dá)TIPE2，蛋白印跡證實(shí)Treg細(xì)胞中存在清晰的TIPE2條帶，同時(shí)檢測到147 bp大小的特異性TIPE2目的基因條帶。證明TIPE2在小鼠CD4+CD25+ Treg細(xì)胞內(nèi)存在表達(dá)。通過采用小RNA干擾技術(shù)（siRNA）沉默TIPE2表達(dá)，我們進(jìn)一步分析TIPE2對CD4+CD25+ Treg免疫抑制活性的影響，觀察到刺激活化的CD4+CD25+ Treg細(xì)胞CTLA-4和Foxp3表達(dá)明顯下降，同時(shí)IL-10和TGF-β生成量顯著減少；此外，CD4+CD25+ Treg對效應(yīng)T細(xì)胞的抑制功能明顯減弱。說明TIPE2作為一種重要的負(fù)向調(diào)控分子，在CD4+CD25+ Treg細(xì)胞中表達(dá)并影響CD4+CD25+ Treg的免疫抑制功能[15]。

    4 研究展望

    綜上所述，負(fù)向調(diào)節(jié)途徑在膿毒癥復(fù)雜的炎癥免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用及意義。目前，膿毒癥確切發(fā)病機(jī)制、早期診斷與防止策略仍然是現(xiàn)代創(chuàng)（燒）傷外科和危重病醫(yī)學(xué)亟待解決的重大難題。對創(chuàng)（燒）傷后機(jī)體免疫功能平衡狀況與動態(tài)變化的了解尚缺乏客觀準(zhǔn)確的指標(biāo)和評估體系，中樞和外周器官中免疫負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞、受體、分子及其信號通路改變能否為膿毒癥的早期識別、病程監(jiān)測、預(yù)后評估提供有價(jià)值信息尚有待進(jìn)一步探討。負(fù)向調(diào)控途徑在膿毒癥免疫功能紊亂中的確切臨床意義如何？對疾病的轉(zhuǎn)歸發(fā)揮怎樣的調(diào)節(jié)效應(yīng)？通過何種途徑實(shí)現(xiàn)對機(jī)體免疫反應(yīng)的平衡調(diào)節(jié)等諸多關(guān)鍵問題均有待深入研究。