前列腺癌是一種發(fā)病率頗高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第二，而在美國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率已于2010年超越肺癌，成為第1位危害男性健康的腫瘤。在美國(guó)，僅2010年就有217730例新發(fā)前列腺癌病例，其中32050例死于該病。在我國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率近年來(lái)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，1993年，前列腺癌發(fā)病率為1.71人/10萬(wàn)人，死亡率為1.2人/10萬(wàn)人，1997年，前列腺癌發(fā)病率為2.0人/10萬(wàn)人，至2000年，前列腺癌發(fā)病率已上升至4.55人/10萬(wàn)人。2007年，上海市疾病預(yù)防控制中心報(bào)道的男性前列腺癌發(fā)病率為11.81人/10萬(wàn)人，居男性惡性腫瘤第5位。

    目前臨床上對(duì)于前列腺癌的早期診斷或篩查，主要依賴血清前列腺特異性抗原（PSA）水平。然而作為早期診斷的標(biāo)記物，PSA仍然缺乏最佳的特異性和敏感性。因此，尋找新的前列腺癌分子診斷標(biāo)記物來(lái)輔助或最終替代PSA作為前列腺癌的早期診斷標(biāo)記，一直是臨床工作者研究的熱點(diǎn)。

    一、基因檢測(cè)在前列腺癌分子診斷標(biāo)記物探索中的應(yīng)用

    眾所周知，很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，除環(huán)境因素外，還與患者自身的遺傳特性有著密切的關(guān)系，因此，在基因?qū)用鎸ふ仪傲邢侔┓肿訕?biāo)記物是人們很自然而然想到的方法。目前，已有一定數(shù)量的基因位點(diǎn)被認(rèn)為可能與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。

    1.遺傳性前列腺癌基因區(qū)域1（HPC1）：位于1號(hào)染色體（1q24～25），是前列腺癌的一個(gè)重要基因易感區(qū)，在1q25位點(diǎn)存在2-5A合成酶依賴性基因（RNASEL）。該基因的改變，被認(rèn)為與前列腺癌的發(fā)生存在著密切的關(guān)系。同時(shí)R?kman等[5]的研究也證實(shí)，RNASEL中E265X片段的丟失和R462Q錯(cuò)義突變與前列腺癌發(fā)病率的升高有關(guān)?？梢?jiàn)，該基因區(qū)域具有成為前列腺癌分子診斷標(biāo)記的潛力。

    2.TMPRSS2-ETS融合基因：TMPRSS2編碼一種雄激素依賴性的轉(zhuǎn)膜絲氨酸蛋白酶。而ETS編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)很多與癌癥相關(guān)的生物過(guò)程。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，前列腺癌組織中廣泛存在著位于21號(hào)染色體（21q22.3）的TMPRSS2-ETS融合基因。該融合基因使ETS基因借助TMPRSS2基因的啟動(dòng)子被激活，從而啟動(dòng)了ETS轉(zhuǎn)錄因子在癌癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。目前，已有更多的學(xué)者在研究前列腺癌患者白細(xì)胞及其他組織細(xì)胞中這一融合基因的出現(xiàn)率，如果得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，則該融合基因可以作為前列腺癌早期診斷甚至預(yù)測(cè)的標(biāo)記。

    3.腫瘤抑制基因CpG島高甲基化：位于腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島的高甲基化是一個(gè)重要的基因失活機(jī)制。這一改變會(huì)破壞細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)而導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤演進(jìn)，該機(jī)制幾乎存在于所有腫瘤中。一系列研究證明檢測(cè)異常高甲基化在腫瘤檢測(cè)和進(jìn)展預(yù)測(cè)中具有很大的應(yīng)用前景。目前研究表明，90%的前列腺癌中存在谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1基因（GTSP1）高甲基化，它是前列腺癌中最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)改變。有研究報(bào)道，聯(lián)合檢測(cè)GSTP1和APC基因的高甲基化，對(duì)前列腺癌的診斷敏感性高達(dá)98.3%，特異性為100%。而更重要的是，這一檢測(cè)目前已經(jīng)可以通過(guò)血清標(biāo)本實(shí)現(xiàn)，這就為這一研究的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了更為廣闊的空間。

    上述研究主要是通過(guò)定量RT-PCR等“傳統(tǒng)”方法來(lái)進(jìn)行的。而近年來(lái)，全基因組相關(guān)性研究（GWAS）的迅猛發(fā)展，為前列腺癌發(fā)生相關(guān)基因的篩選提供了新的手段。這一技術(shù)是一種檢測(cè)特定物種中不同個(gè)體間的全部或大部分基因，從而了解不同個(gè)體間的基因變化有多大的一種方法。目前已有數(shù)十篇通過(guò)GWAS技術(shù)篩選前列腺癌發(fā)病相關(guān)基因的文獻(xiàn)發(fā)表，被報(bào)道的相關(guān)基因達(dá)數(shù)十個(gè)，但尚未發(fā)現(xiàn)其中的某一基因在診斷前列腺癌方面顯著優(yōu)于其他基因。不過(guò)，隨著GWAS技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，參與機(jī)構(gòu)的增加以及病例數(shù)的累積，相信在不久的將來(lái)，即可篩選出可以用于診斷前列腺癌的標(biāo)志性基因。

    二、蛋白質(zhì)芯片在前列腺癌分子診斷方面的貢獻(xiàn)

    蛋白質(zhì)芯片曾經(jīng)在多種疾病分子診斷標(biāo)記物的篩選研究中風(fēng)靡一時(shí)。但近年來(lái)，隨著更多新技術(shù)的發(fā)展，這一研究手段的“地位”已大不如前。但是，我們不應(yīng)遺忘該技術(shù)為前列腺癌分子診斷標(biāo)記物的探索所作出的貢獻(xiàn)。Gelmann等對(duì)PubMed上公布的芯片研究結(jié)果進(jìn)行了薈萃分析，比較了前列腺癌組織和正常組織，顯示了兩者之間一系列差異和共同點(diǎn)。以下分子標(biāo)記物的篩選，均是通過(guò)這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。

    1.前列腺癌抗原3（PCA3）：PCA3是近年來(lái)備受關(guān)注的前列腺癌分子診斷標(biāo)記物之一。編碼這一蛋白的基因位于9號(hào)染色體上（9q21～22）。Hessels等首先報(bào)道了通過(guò)檢測(cè)尿液中PCA3的濃度來(lái)診斷前列腺癌的案例。有報(bào)道稱，該蛋白在診斷前列腺癌方面的靈敏度和特異度分別為65%和66%，優(yōu)于經(jīng)典的標(biāo)志物PSA。

    2.早期前列腺癌抗原（EPCA）：EPCA是一種核基質(zhì)蛋白。在前列腺癌與對(duì)照人群中EPCA染色強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其敏感性和特異性分別為84%和85%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)具有病理陰性但抗EPCA抗體染色陽(yáng)性活檢組織的男性在將近5年或5年后被診斷為前列腺癌。因此，該蛋白不但具有診斷前列腺癌的作用，甚至可以用于前列腺癌發(fā)病的預(yù)測(cè)。

    三、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)在篩選前列腺癌分子診斷標(biāo)記物中的應(yīng)用

    iTRAQ是2004年美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出的一種利用同位素標(biāo)簽標(biāo)記技術(shù)可以同時(shí)對(duì)相同實(shí)驗(yàn)條件下4個(gè)樣本進(jìn)行定量研究的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。iTRAQ實(shí)際上是一種同位素標(biāo)記試劑，包括一個(gè)帶電荷的報(bào)告基團(tuán)，報(bào)告基團(tuán)有四種相對(duì)分子質(zhì)量分別為114Da、115Da、116Da和117Da，另外還有一個(gè)肽段反應(yīng)基團(tuán)和一個(gè)平衡基團(tuán)，平衡基團(tuán)也有四種相對(duì)分子質(zhì)量分別為31Da、30Da、29Da和28Da。其中平衡基團(tuán)平衡相對(duì)分子質(zhì)量，保證與每一種報(bào)告基團(tuán)結(jié)合后iTRAQ試劑總的相對(duì)分子質(zhì)量都是145Da；肽段反應(yīng)基團(tuán)可以同肽段的N-末端和賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，這樣可以標(biāo)記生物樣品產(chǎn)生的所有肽段，增強(qiáng)任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時(shí)保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結(jié)構(gòu)信息。以四個(gè)樣本為例，實(shí)驗(yàn)流程為：每個(gè)樣本進(jìn)行還原、烷基化及胰蛋白酶水解處理后，所有肽段進(jìn)行iTRAQ試劑標(biāo)記，然后將所有樣品混合在一起進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。標(biāo)記的母體肽段經(jīng)過(guò)碰撞誘導(dǎo)的解離后，報(bào)告基團(tuán)表現(xiàn)為分子量在114、115、116、117Da的報(bào)道離子，而且同時(shí)產(chǎn)生殘存的y-和b-離子化標(biāo)記肽段。這些報(bào)道離子主要用于蛋白質(zhì)的相對(duì)定量。因?yàn)閳?bào)道離子主要分布在低分子量區(qū)，一方面盡可能的忽略自身的重量，降低不同質(zhì)譜鑒定模式產(chǎn)生的差異；另一方面消除其他離子化片段的干擾，保證肽段豐度最高的可信度。因此報(bào)道離子豐度的差異，代表了不同樣本中同一肽段豐度的差異，從而最終確定不同樣本中同一蛋白質(zhì)豐度的差異即相對(duì)定量信息。而y-和b-離子化標(biāo)記肽段主要用于蛋白質(zhì)鑒定。

    Glen等首次利用iTRAQ技術(shù)對(duì)前列腺癌細(xì)胞系進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，最終發(fā)現(xiàn)了10種蛋白存在上調(diào)，4種蛋白存在下調(diào)，存在差異表達(dá)的腦肌酸激酶（CKBB）、兒茶酚胺鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）、腫瘤排斥抗原（gp96）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78kDa（grp78）等已通過(guò)Western-blot和2DGE進(jìn)一步得到了驗(yàn)證。

    筆者同樣通過(guò)這一技術(shù)，對(duì)中國(guó)人群中前列腺癌患者、前列腺上皮內(nèi)瘤變（PIN）患者、良性前列腺增生（BPH）患者前列腺穿刺標(biāo)本中各種蛋白的差異性進(jìn)行了分析，最終發(fā)現(xiàn)了TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu在前列腺癌中分別上調(diào)4.25倍、4.57倍和3.02倍，而Decorin下調(diào)0.43倍。Western-blot的驗(yàn)證結(jié)果與iTRAQ的分析結(jié)果相一致。

    因此我們可以認(rèn)為，iTRAQ技術(shù)在前列腺癌分子標(biāo)記物的篩選中具有很大的潛力。

    除了上述技術(shù)外，尚有免疫組化等方式可對(duì)前列腺癌患者與對(duì)照組中蛋白的差異進(jìn)行研究。相信隨著各種實(shí)驗(yàn)手段的發(fā)展，我們會(huì)找到更多的手段來(lái)尋找更具臨床意義的差異表達(dá)蛋白。

    四、總結(jié)與展望

    綜上所述，前列腺癌的診斷目前仍依賴于PSA的檢查。雖然很多新的分子診斷標(biāo)記物（包括特定基因位點(diǎn)、差異蛋白等）已經(jīng)越來(lái)越多地被報(bào)道，但目前還都處于研究階段，正式應(yīng)用于臨床尚需時(shí)日。不過(guò)，隨著研究的進(jìn)展，被報(bào)道的標(biāo)記物或研究手段會(huì)進(jìn)一步增加，這將為我們提供了一個(gè)巨大的“候選庫(kù)”，而從中篩選出最理想的前列腺癌分子診斷新標(biāo)記也將不再困難。相信在不久的將來(lái)，我們可以找到一種或幾種具有高敏感性、高特異性，易于提取、檢驗(yàn)的標(biāo)記物，從根本上解決前列腺癌診斷中的種種困境，為廣大男性的健康做出新的貢獻(xiàn)。