【DOC】微生物限度檢查法 - 醫(yī)學(xué)資源下載
資源作者：張琳琳1
資源分類(lèi)：醫(yī)學(xué) - 檢驗(yàn)科
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上傳日期：2013-01-05 14:21:56

中國(guó)藥典（2010版）微生物檢測(cè) 微生物限度檢查法 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。 微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000 級(jí)下的局部潔凈度100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》 的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。 供試品檢查時(shí)．如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。 除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28 ℃ 。 檢驗(yàn)結(jié)果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。 檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g 、ml 或cm2）。 除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；膜劑為100 cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門(mén)菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。 檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用星（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3 倍最供試品。 供試液的制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過(guò)45℃ 。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò)1 小時(shí)。 除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。 1.液體供試品 取供試品10ml ，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，混勻，作為l:10 的供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。 2.固體、半固體或黏稠性供試品 取供試品10g ，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml ，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80 ，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。 3.需用特殊方法制備供試液的供試品 （1）非水溶性供試品 方法1 ??取供試品5g（或5ml ) ，加至含溶化的（溫度不超過(guò)45℃ ）5g司盤(pán)80 、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80 無(wú)菌混合物的燒杯中，用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加人45 ℃ 的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml ，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1 : 20 的供試液。 方法2 取供試品10g ，加至含20ml 無(wú)菌十四烷酸異丙酯（制法見(jiàn)附錄XII A 無(wú)菌檢查法中供試品的無(wú)菌檢查項(xiàng)下）和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中．必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 ℃ 的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10Oml ，振搖5～10 分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為l : 10 的供試液。 （2）膜劑供試品 取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml （必要時(shí)可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10 的供試液。 （3）腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品10g ，加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml ，置45 ℃ 水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10 的供試液。 （4）氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適覺(jué)的無(wú)菌聚山梨酯80 ）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml 的供試品，再稀釋成1:10 的供試液。 （5）貼劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無(wú)菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鐘，制成供試液。貼劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。 （6）具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。 ① 培養(yǎng)基稀釋法?? 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液2ml ，每1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。 ② 離心沉淀法?? 取一定量的供試液，500 轉(zhuǎn)／分鐘離心3 分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。 ③ 薄膜過(guò)濾法?? 見(jiàn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的“薄膜過(guò)濾法”。 ④ 中和法?? 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。 菌種?? 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ] 枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis ?) [ CMCC ( B ) 63501 ] 白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕 黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ] 菌液制備? 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 ～24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0 . 9 ％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml 含菌數(shù)為50～100CFU 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 ～7 天，加人3 ～5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 ％無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每lml 含孢子數(shù)50 ～ 100CFU 的孢子懸液。 菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8 ℃ ，可在24 小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 ～8 ℃ ，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。 適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100CFU ，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃ 培養(yǎng)48 小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100CFU ，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置23 ～28 ℃ 培養(yǎng)72 小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50 ～100CFU ，注入無(wú)菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基．平行制備2 個(gè)平皿，混勻，凝固，置23 ～28 ℃ 培養(yǎng)72 小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。 結(jié)果判定? 若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70 % ，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。 計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證 當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。 驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。 菌種及菌液制備? 同計(jì)數(shù)培養(yǎng)鑒的適用性檢查。 驗(yàn)證方法 驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。 ( l )試驗(yàn)組?? 平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液lml 和50 ～100CFU 試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加人50～100CFU 試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。 ( 2 )菌液組?? 測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。 ( 3 )供試品對(duì)照組?? 取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。 ( 4 )稀釋劑對(duì)照組?? 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每lml 供試液含50 ～100CFU ，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。 結(jié)果判斷? 在3 次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70 % 。若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70％，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70 % ，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過(guò)濾法、中和法（常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法見(jiàn)表1 ）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。 表l 常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類(lèi)、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類(lèi) 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類(lèi)化合物（QACs ）、對(duì)羥基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 ? 汞類(lèi)制劑 亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類(lèi)化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰類(lèi) 聚山梨酯 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA ) 鎂或鈣離子 磺胺類(lèi) 對(duì)氨基苯甲酸 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素 β-內(nèi)酰胺酶 ? 若沒(méi)有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。但是，供試品也可能僅對(duì)試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，采用上述方法若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢驗(yàn)。 驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。 供試品檢查 計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過(guò)濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。 按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試

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